小肠道粘膜的病毒内显微镜可以提供不同免疫细胞类型之间或这两个隔间之间上皮内细胞相互作用的时空动力学的洞察。该技术的主要优点是，它允许实时获取肠道粘膜内的高速高分辨率图像。肠道的活成像可以提供额外的洞察细胞相互作用，或细胞信号涉及粘膜免疫，上皮生物学或癌症生物学。
这是一个具有挑战性的方法，需要手术技术的实践，以及耐心和最佳定位的鼠标图像采集。在确认麻醉转基因小鼠对手趾捏缺乏反应后，表达增强的绿色荧光蛋白，或EGFP，伽玛-德尔塔T细胞受体，使用块茎素注射器缓慢地将200微升新鲜准备的 Hoechst 33342 染料溶液注入复古轨道静脉鼻窦中。注射一到两分钟后，在动物的眼睛上涂抹软膏，防止它们干涸。
然后，沿着下腹部的中线，通过皮肤和腹膜进行2CM垂直切口，并使用倾斜钳子小心地将腹腔拉出。确定小肠的2-3CM区域，其中含有最少的粪便，注意不要撕裂肠内血管，并小心地将小肠和剩余的小肠返回到腹腔，使感兴趣的部分外化。在下划线两侧放置两对钳子，轻轻将钳子的尖端揉在一起，在膜上形成一个孔。
使用倾斜钳子和连接到5CM缝合的弯曲锥点针，通过膜上的孔穿透内膜的一侧，并通过内膜衬里的另一侧，将一个缝合线放在顶部，另一个缝合线靠近切口底部，以关闭切口，同时保持肠道的环外化。为了增加成功的可能性，在放置腹部缝合时不要绑住或撕裂任何血管，并限制对肠道的任何无关处理。然后，以相同的方式关闭肠道环下的皮肤，在下划线内先前缝合线之间的切口中间放置一个缝合线。
使用电烧，沿着肠边界进行穿孔，并立即将几滴水涂抹到肠道表面，以防止额外的热诱发组织损伤。用金擦来去除残留的水。使用 vanna 剪刀在烧灼组织端边缘沿烧灼线的长度向外部化组织段的近端切割大约 1.5CM 的水平狭缝。
当粘膜表面暴露时，用湿润的金擦盖住腹部，以保持组织水分。对于旋转磁盘共微显微镜成像，将鼠标在有盖容器中运送到显微镜。启动成像软件，将显微镜的头部向后倾斜，在玻璃盖的滑动底部添加 150 微升 1 微摩尔跳蚤 Alexa Fluor 染料和 Hank 的缓冲盐水溶液。
放置鼠标，使打开的粘膜表面直接接触盖玻片。将鼠标和碟子放在预热培养箱的成像阶段。将每个激光器的激发强度和曝光时间分别设置为不超过 10-15 毫瓦和 120-150 毫秒，并调整帧平均值为 2。
打开电子倍增增益功能以减少背景噪声，并选择 63 倍目标校准以确保正确测量像素大小。使用 405 纳米激光和 20X 空气目标，手动可视化核，以定位缺乏明显运动或漂移的 villi 场，避免因呼吸、呼吸或心跳而导致的伪运动区域。使用 X-Y 扫描，记录感兴趣领域的 X-Y 坐标，并切换到甘油浸入 63 倍目标。
在 405 纳米通道上获取实时图像长达 1 分钟，以确认选定字段中的 villi 稳定，同时调整焦点以查找 villus 尖端正交平面。然后获取 z 堆栈，从 villus 尖端上皮的正下方开始，大约 15-20 微米到 villus，直到使用 1.5 微米步很难解析核。采集开始3-5分钟后，确认图像稳定性和伽玛-德尔塔内细胞运动，并继续获取图像30-60分钟，每个领域的villi。
伽玛-德尔塔-三角洲宫内淋巴细胞表现出一种动态监测行为，它们通过沿着基底膜迁移进入研究状态的横向细胞间空间来巡逻上皮。在这些具有代表性的图像中，彩色轨迹指示单个伽玛-三角洲内淋巴细胞在30分钟内的迁移路径。虽然在使用抗白细胞-2受体β抗体治疗的小鼠中，腹间淋巴细胞的频率增加，但超过30%的伽玛-三角洲宫内淋巴细胞表现出空转行为。
这种空转表型的证实是，与控制相比，伽玛-三角洲宫内淋巴细胞的瞬时速度和禁闭率显著降低。此外，与动量伽玛-德尔塔三角洲宫内淋巴细胞相比，闲置伽玛-德尔塔-三角洲宫内淋巴细胞的停留时间较长，在横向细胞间空间内更频繁地局部化。很难识别由于近位而缺乏过度运动的维利领域。
重新定位鼠标可能有助于定位更稳定的字段。进一步分析细胞跟踪数据可能有助于确定特定的活动行为，或为测量细胞相互作用提供额外的指标。IEL-活动性在病毒内成像和分析已成为 IEL 功能的标准读出，提供了对先天免疫信号如何调节伽玛-德尔塔 IEL 功能的洞察。
