全骨髓的制备,用于中性粒系细胞的大规模细胞测定分析

这种质量细胞学方案保留了整个骨髓的完整性，允许抢救在常规样品制备过程中丢失的信息，以便对研究不足的细胞进行分析。这种快速和毫不费力的骨髓分离方案有助于获得可行的短寿命骨髓细胞群，如罕见的嗜中性粒细胞系子集。使用大规模细胞学来识别以前被低估的免疫细胞，如嗜中性粒细胞-血统细胞可能对各种疾病有广泛的影响。

该协议保留了骨髓中存在的短寿命骨髓细胞的完整性，并可以很容易地应用于其他组织类型，如实体肿瘤。我们简化为协议，使其尽可能用户友好，但作为在所有生物研究中，它可能需要一些实践运行来管理。首次这样做时，您可以先准备好所有试剂，然后严格遵守协议。

如果您遇到任何问题，您可以连接到 CyTO 论坛，并与可以帮助故障排除的其他 CyTOF 用户交谈。对于生物样品制备，简单的技巧可以产生巨大的差异与最终结果。对于新用户来说，可视化演示更容易掌握协议。

如果您是第一次这样做，您可以先准备好您的试剂，然后严格遵守协议。对于骨髓收获，将一只6至10周大的C57黑色六只小鼠放在无菌手术垫上，使用70%乙醇对腹部和后肢进行消毒。使用一双解剖手术剪刀打开腹腔，取出皮肤露出后肢。

使用一对钝尖敷料钳，将鼠标头骨放在脚踝下方，并使用一对弯曲的修整钳来稳定钝尖敷料钳下方的头骨。使用钝尖敷料来打破头骨并取出肌肉以露出骨骼。在将头骨置于冷 PBS 中之前，将稳定弯曲的修整钳移动到股骨上，并将钝倾斜敷料滑到膝盖关节下方以握住膝盖。

轻轻拉起，使膝盖脱位，将肌肉从膝盖上取下，露出股骨。用弯曲的修整钳抓住暴露的股骨，并使用手术剪刀将股骨从骨骼底部切开。然后将股骨放在 PBS 中。

接下来，使用 18 量针在 0.5 毫升微型离心管中打孔，将两个骨骼放在管中，骨骼的开端朝下进入孔中。将 0.5 毫升管放入 1.7 毫升微型离心管中，并在微型离心机中旋转双层管。在离心结束时，确认骨髓已被提取到管的底部。

要染色骨髓细胞进行大规模细胞切除术，在室温下将骨髓重新悬浮在一毫升红细胞解液缓冲液中10分钟。在孵育结束时，通过离心收集细胞，并在一毫升冷PBS中重新悬浮颗粒。通过70微米滤网将细胞过滤成15毫升的圆锥管，用9毫升的新鲜冷PBS清洗细胞。

将骨髓细胞颗粒重新悬浮在10毫升新鲜、冷的PBS中，进行计数，将五倍10的骨髓细胞等分转移到新的15毫升管中。通过离心收集细胞，将细胞重新悬浮在一毫升质量细胞测量染色缓冲液中，辅以125纳米摩尔顺铂。在室温下五分钟后，将细胞用四毫升新鲜质量的细胞测量缓冲液清洗。

将颗粒重新悬浮在50微升的FC受体阻断溶液中。在4摄氏度下10分钟后，将50微升的抗体混合物加入细胞中，轻轻移液混合。不同孵化步骤的温度对于保持骨髓细胞的生存能力非常重要。

在4摄氏度下30分钟后，每次洗涤两毫升新鲜质量细胞热缓冲液中清洗细胞，然后将细胞重新悬浮在新鲜准备的1.6%甲醛中，在室温下15分钟。在孵化结束时，通过离心收集细胞，将颗粒重新悬浮在一毫升固定过长缓冲液中，并辅以125纳米摩尔间分液，在4摄氏度下进行隔夜孵育。在通过质量细胞学分析细胞之前，轻轻涡流和离心细胞悬浮液，然后用两毫升新鲜质量细胞学染色缓冲液清洗细胞。

接下来，每次洗涤一毫升蒸馏水两次，在第二次洗涤后小心吸升液，然后将细胞重新悬浮在每毫升质量细胞测量缓冲液浓度的1倍10至第六细胞，用于大规模细胞测量分析。在此 T 分布式随机邻域嵌入图中，根据由 33 参数质量细胞学面板测量的表面标记表达式配置文件的相似性，将多个小鼠组织的细胞聚类到子集中。具有更多相似属性的单元格根据每个单元格上的这些标记的表达式自动聚聚在一起。

使用这种方法，保留了整个骨髓的完整性，导致发现一个以前未知的细胞群体，同时共同表达嗜中性粒细胞和造血干细胞和祖细胞特征表面标记。由于Ly6G正细胞耗竭，这种细胞群体在骨髓祖体研究中先前被省略，表现出明显的表面标记表达模式。更重要的是，这些数据导致发现了Ly6G正细胞簇的一小部分，该组集没有表达Ly6G，而是与CD117阳性Ly6G阳性细胞紧密聚类，这表明这些细胞与中性粒细胞谱系的相似性，基于该大规模囊细胞学实验中使用的33个表面标记的表达。

然后可以建立一个13色荧光激活细胞分拣面板，通过流式细胞学分离中性粒细胞，进行下游功能测定。重要的是尽快执行骨髓分离程序，并在染色过程中将细胞保持在摄氏四度。