活体细胞毒性试验研究肿瘤特异性 CD8⁺ t 细胞反应中的免疫调节

这种测定可用于同时对肿瘤抗原的两种不同肽表位进行定量T细胞培养的细胞毒性。这种测定的体内性质允许在二级淋巴器官的完整结构内测量T细胞的细胞毒性功能。此外，观察到的杀戮是T细胞的绝对数量的准确反映，而不仅仅是它们的频率，这可能具有误导性。

此测定能够检查细胞毒性T细胞对免疫主导和亚显性肿瘤抗原的反应。因此，当您设计疫苗时，它提供了有价值的信息，以及癌症的免疫治疗方案。我们的协议是专为研究CD8T细胞反应而定制的。

然而，它可以被修改来测量其他杀手细胞类型，如NK细胞和先天类T淋巴细胞引出的细胞毒性。这种测定需要无菌技术、小鼠组织处理、目标细胞准备以及尾静脉注射方面的专业知识。在尝试体内杀戮分析之前，需要获得这种技能。

一旦T-抗原阳性粘附肿瘤细胞系完全汇合或稍微过汇，用无菌、温暖的PBS轻轻冲洗单层，并在生物安全柜中用0.25%的胰腺素EDTA分离肿瘤细胞。多次点击培养瓶的两侧以释放剩余的粘附细胞，并在大约五分钟后停止反应，加入5毫升DMEM培养基。在通过70微米孔细胞滤株将细胞悬浮液过滤到50毫升锥形管之前，先将细胞溶液移液几次。

通过离心收集细胞，并在相同条件下将颗粒重新在10毫升无菌、冷PBS中重新供应，进行三次洗涤中的第一次。第三次洗涤后，将细胞以每毫升无菌PBS浓度的4倍10重新悬浮到7个细胞，并每6至12周大的C57 Black 6小鼠接受者体内注射500微升T-抗原阳性肿瘤细胞悬浮液。为进行目标飞溅细胞制备，将安乐死供体小鼠放在易发位置，用70%乙醇喷洒动物。

使用无菌钳子和剪刀，抬起皮肤，做一个小的腹中线切口。以交叉方式切割皮肤，露出内膜，用钳子以帐篷式的方式拉起内膜，而不抓任何内脏。切开腹膜，露出腹腔，轻轻将脾脏转移到含有5毫升无菌PBS的15毫升Dounce组织研磨机中。

使用柱塞施加手动压力，直到血%组织消散成红色均质细胞悬浮液，然后将均质质转移到15毫升管中。通过离心收集悬浮液，将颗粒重新悬浮在四毫升氯化铵碳酸钾解氧水缓冲液中，以消除红细胞。四分钟后，用8毫升全介质停止这个过程，并通过70微米孔细胞滤株将细胞悬浮液过滤到新的50毫升管中。

通过离心将白血球从红细胞碎片中分离，并在12毫升的完整介质中重新将颗粒重新暂停。然后将飞毛细胞悬浮液分成三个相等的四毫升等分。对于目标飞溅细胞的肽编码，脉冲一个飞毛细胞等同物与一微摩尔无关肽，一个等同与一个微摩尔的站点一肽，一个等分与一个微摩尔的站点IV肽在37摄氏度和5%二氧化碳。

在孵育结束时，通过离心去除多余的肽，每管洗涤12毫升无菌、冷PBS两次，洗涤肽脉冲的飞溅细胞两次。第二次洗涤后，每管将细胞重新用四毫升新鲜、无菌的PBS中重新暂停。将025、0.25和双微摩尔CFSE分别添加到不相关的站点一和站点IV肽脉冲飞溅细胞悬浮液中。

将管子在 37 摄氏度下放置 15 分钟，每 5 分钟手动反转一次。在孵化结束时，将三毫升热灭活的胎儿牛血清添加到每个管中，以停止CFSE反应，并将每管的最终体积与PBS一起达到15毫升。然后通过离心收集染料标记的细胞，每次洗涤 12 毫升新鲜、无菌 PBS 中洗两次。

要确认目标飞毛细胞的充分CFSE标签，将颗粒重新在PBS的三毫升中，与温和的涡流混合。将每个 CFSE 标记的电池悬浮液中的 10 微升转移到单个五毫升圆形底部聚苯乙烯荧光活性细胞分选或包含 PBS 的 FACS 管中，然后将管加载到装有 488 纳米激光器的流动细胞仪上。在流细胞仪软件中，在获得属于荧光1通道淋巴细胞门内的5，000个事件之前，根据细胞的向前散射和侧散射特性创建淋巴细胞门。

在父 CFSE 阳性总体中，绘制额外的直方图门以识别 CFSE 低、CFSE 中间和 CFSE 高亚人口。然后，在三个门内确认其他两个标记单元格管的相等或接近相等的事件编号。对于目标细胞的注射，首先轻轻涡旋源管，然后以相等的比例将三个 CFSE 标记的细胞悬浮液集中到新管中。

用无菌PBS对管内装物进行加上，通过离心收集细胞进行计数。然后将体积调整为每接收方每200微升PBS的7个混合靶细胞，将200微升细胞悬浮液注入每个接受者C57 Black 6小鼠的尾静脉。注射后两四个小时，取出并处理每个接受动物的脾脏，并重新将分离的白血球注入每只脾脏三毫升PBS中。

将每个加工脾脏的大约 1 倍 10 到 7 个细胞转移到一个干净的 FACS 管中，并立即运行流细胞仪上的细胞，如证明要打开 CFSE 低、中间和高目标细胞群。然后在荧光1通道中获取总共2，000个CFSE-Low事件，并根据文本中详述的公式计算每个共生靶细胞群体的具体解解。在这个具有代表性的实验中，在注射抗CD25单克隆抗体的小鼠中，自然产生的调节T细胞的耗竭成功得到了流细胞学的证实。

正如预期的那样，在天真的小鼠中，可检测到与对照细胞和同源靶细胞相对应的接近相等的峰值。相比之下，无论之前使用抗CD25单克隆抗体或PBS治疗，T-抗原-原基因小鼠几乎完全不存在位-IV显示靶细胞。有趣的是，自然发生的T reg细胞耗尽由抗CD25单克隆抗体增强体内细胞毒性T淋巴细胞-细胞细胞-中培养的位点-I脉冲靶细胞。

在第二次代表性调查中，编程死亡1封锁增强亚显性CD8阳性T细胞位点1和2斜线-三特异性反应，表明干扰编程死亡1/编程死亡配体1相互作用可能诱发抗癌CD8阳性T细胞反应的表位扩散。在使用 CFSE 标记供体细胞时，确保浓度精确至关重要。否则，这可能会导致直方图峰值重叠，这会使所需的计算和数据解释变得困难（如果不是不可能的话）。

优化体内细胞毒性测定非常重要，以量化不同杀手细胞类型在相同宿主中识别肽和非肽抗原所引出的效应器功能。