患者衍生的胰腺癌异质异种移植模型,使用斑马鱼幼虫作为比较药物评估的宿主

今天，我们将介绍一个幼虫斑马鱼PDX模型。此模型非常重要，因为它们可以更好地模拟异种移植中类似的细胞成分，用于评估药物反应，并进一步提高结果与比较分析的一致性。这种技术有两个主要优点。

首先，我们使用各种标准化学染料将细胞标记为不同的荧光，从而能够实时跟踪细胞组成和分析相的能力。其次，它还提高了斑马鱼中人类细胞的一般生存时间，其基因改造为药物检测提供了更长的观察窗口。该技术为胰腺癌患者个性化药物和临床前肿瘤药物的预评估提供了潜在的模型。

该方法还可用于追踪体内斑马鱼中其他肿瘤细胞或无肿瘤细胞异种移植，并改善细胞存活时间较长。要准备注射板，请准备在E3溶液中用1%的加糖溶液中，使用50毫升溶液。煮溶液，直到加糖溶解。

将整个溶液倒入10厘米培养皿中，然后将斑马鱼胚胎固定模具放在表面。当加糖溶液完全凝固时，拆下模具。要准备注射针，请使用拔针器将内尺寸为 0.9 毫米的 10 厘米玻璃毛细管拉入两根针中。

使用显微镜和钳子切割针头的端，以创建开口。首先，将一对到两对成年斑马鱼放入一个交配罐中，大约在七到九个下午。第二天早上8点，收集受精卵。将受精卵转移到含有 40 毫升新鲜 E3 溶液的培养皿中。

在28.5摄氏度下孵育。首先，将收集的胰腺癌样本转移到培养皿中。用PBS冲洗组织五到六次，然后用手术刀将组织切成一毫米的立方体。

接下来，将切碎的组织转移到含有5毫升HBVS的50毫升管中。添加胶原酶四型，葫二丁酶，和DNAse一在最终浓度显示这里。上下移液混合物，以混合良好。

在37摄氏度的20%二氧化碳培养箱中孵育混合物15至20分钟。每五分钟向上和向下移液几次混合物。在管子中加入七毫升DMEM。

在110倍G和4摄氏度下离心5分钟。然后，在DMEM中抽取上能和肿瘤混合物，然后重新悬浮。将混合物镀入两个六厘米培养皿，含有三毫升的全生长介质，名为第一组和二组。

在5%的二氧化碳孵化器中，在37摄氏度下孵育两组。48小时后，将胰腺癌成纤维细胞的100倍抑制剂加入第一组培养基中，去除过度生长的成纤维细胞，使癌细胞成为主要细胞类型。使用以前的条件继续孵育。

产生扁病毒后，将细胞播种到密度为30%至40%的12井板中。在5%的二氧化碳培养箱中，在37摄氏度的温度下一夜之间培养细胞。第二天，以每毫升8微克的浓度更换含有多纤维素的500微升无血清介质。

在37摄氏度下孵育，用5%的二氧化碳孵育4小时。然后，在介质中再添加100微升的扁病毒，并再次孵育12小时。12小时后，用两毫升完全的介质代替该介质，再孵育36小时。

36 小时后，检查荧光标记。收获受感染的细胞，以一比一的比例混合，最终浓度为每毫升一百万个细胞。将细胞在110倍G下离心5分钟，并在50微升注射溶液中重新悬浮细胞混合物。

麻醉斑马鱼幼虫后，将它们转移到注射板，注射板中填充了经过修饰的E3。将混合细胞悬浮液的25微升放入微胶囊针中，并将针头插入微注射操纵器。设置注射压力和时间，将50至80个细胞注射到受精后48小时的蛋黄囊中。首先，在32摄氏度下将后泽纳鱼幼虫转移到40毫升的混合溶液中。

将 10 个泽诺夫特幼虫放入 12 井板的每个井中。接下来，将幼虫分成四组。使用含有 0.1% DMSO 的 E3 治疗对照组，用 Gemcitabine 和/或 Navitoclax 治疗其他组。

在32摄氏度下孵育所有幼虫两天。麻醉后，对被化的幼虫进行麻醉后，将它们放在3%甲基纤维素中。使用荧光或共合显微镜从横向视图对幼虫进行成像。

然后，使用图像J和图形垫软件量化红色和绿色荧光信号的强度。在这项研究中，原发性癌细胞在消化后被播种到完整的培养中，有或没有胰腺癌成纤维细胞抑制剂。癌细胞和成纤维细胞作为两个不同的种群被丰富。

没有抑制剂的人口以成纤维细胞为主，而癌细胞生长在加入抑制剂后占上风。在BFL2L1中，构建了两种表达绿色或红色荧光蛋白的扁病毒包装载体。基于病毒的荧光标记代表细胞的生存状态。

混合癌细胞和成纤维细胞在受精后48小时被注射到斑马鱼蛋黄囊中，然后用Gemcitabine和/或Naitoclax治疗两天。不同人群的细胞振动和泽诺格拉夫特的细胞组成随着对药物治疗的反应而变化。当处理不同类型的肿瘤时，有几个步骤可能需要反对，包括细胞消化时间，药物治疗剂量，等等。

此技术可帮助研究人员使用标准 CGX 或 PDS 测定中的斑马鱼。它允许以固定比率混合和注射不同的细胞，通过将进展带与细胞生长进行比较来量化进展带。人身保护意义重大，尤其是在包装扁家病毒时。

在适当的时候戴口罩和手套，尽量不要在皮肤上混在皮肤上。