动态核极化固态核磁共振法制备结构澄清用真菌和植物材料

该协议可用于为固态核磁共振（NMR）和动态核极化（DNP）准备用于复杂生物系统表征的真菌和植物材料。这种技术使我们能够研究生物材料在原生环境中的原子分辨率水平，例如，在全细胞中。获得有关真菌材料的高分辨率结构信息将有助于抗真菌药物的发展。

该方法提供了真菌细胞壁中复合碳水化合物的组成和结构的洞察，可应用于许多富含碳水化合物的生物体，包括植物、真菌、藻类和细菌。一些研究人员可能难以与真菌污染在他们的细胞培养。我的建议是在使用前彻底消毒介质和设备，以防止这种污染。

此演示将帮助在 NMR 或细胞培养方面经验很少的调查人员学习如何在真菌和植物系统中实施这些技术。要准备未标记的液体生长介质，在100毫升蒸馏水中溶解6.5克酵母提取物肽葡萄糖或YPD粉末，然后在134摄氏度下将所得溶液溶解25分钟。要准备未标记的固体生长介质，在 100 毫升蒸馏水中加入 6.5 克 YPD 阿加粉，并在 121 摄氏度下将介质冷却至约 50 摄氏度，然后自动清洁介质 25 分钟。

然后，将13至15毫升的熔化固体生长介质转移到单独的无菌塑料培养皿中，并立即将盖子放在盘子上。要准备碳-13、氮-15标记的液体生长介质，根据需要将含同位素最小介质的100毫升体积调整为6.6的pH值，并含有酸或碱。接下来，将表中列出的盐溶解在100毫升蒸馏水中，加入碳-13、氮-15标记的液体生长介质，并在121摄氏度下将所得溶液冷却25分钟。

当溶液冷却至室温时，将100微升微量元素溶液加入到碳-13、氮-15标签的最小介质中。要种植真菌材料，请使用接种循环将少量真菌从储存转移到 YPD 板上，并在 30 摄氏度的培养箱中培养真菌两天。在孵育结束时，使用新的接种回路将活性生长的真菌边缘转移到碳-13、氮-15标记的液体生长介质中，并在摇动的培养箱中将培养物以每分钟30摄氏度和220次旋转，在震动的培养箱中旋转3至5天。

当大量的真菌覆盖烧瓶底部并漂浮在液体中时，通过离心收集真菌并丢弃上清液。用适当的溶液水合颗粒，并使用钳子收集约0.5克的水分良好的颗粒，用于 NMR 和 DNP 分析。然后，将剩余材料与20%甘油溶液混合在锥形管中，将真菌样品放在零下80摄氏度，进行长期储存。

为了准备用于固态核磁共振分析的 A.fumigatus，首先使用具有 3.5 千代顿分子量截止的透析袋，将 0.5 克碳-13、氮-15 标记的真菌样品对一升 10 毫米磷酸盐缓冲液进行三天，以去除生长介质中的小分子。透析结束时，将样品转移到15毫升管中进行离心，将70至80毫克均匀的碳-13标签和水分充足的样品糊包装成4毫米二氧化硅转子。使用金属棒轻轻和重复挤压样品，用纸吸收多余的水。

然后，紧密盖住转子，并将样品插入光谱仪，进行固态 NMR 表征。为了准备用于DNP分析的 A.fumigatus，将100微升DNP基质加入一个1.5毫升微离心管中，每碳-13，碳-15标记真菌样品，并将0.7毫克偏振剂溶解到每个管中，形成10毫摩尔基液溶液。在涡旋2至3分钟后，确保基体完全溶解在溶液中，将10毫克的透析碳-13、氮-15标记真菌样品浸泡在50微升的偏振剂溶液中，并使用害虫和砂浆对混合物进行轻度研磨，确保基体渗透到多孔细胞壁中。

在地面颗粒中再加入30微升的激进溶液，以进一步滋润真菌样品，并将颗粒包装成3.2毫米蓝宝石转子。温和挤压并去除多余的DNP溶剂，如证明，并添加一个3.2毫米的硅胶塞，以防止水化损失。然后，将转子添加到用于常规实验的 NMR 光谱仪或用于微波辐照下 DNP 增强光谱的 DNP 光谱仪中。

要为 DNP 研究准备植物材料，请使用剃须刀刀片将均匀的碳-13 标记的植物材料切割成 1 到 2 毫米的碎片。使用砂浆和害虫将碎片磨成更小的颗粒，直到最终粉末具有均匀的外观。在植物材料中加入40微升10毫摩尔基材溶液，轻轻研磨样品5分钟，确保与基体均匀混合。

用另外 20 微升的激进库存溶液水合地面样品，将平衡的植物样品包装成 3.2 毫米蓝宝石转子，用于 DNP 分析。然后，插入硅胶塞以避免水化损失，并将样品加载到 DNP 分光光度计上。同位素标记大大提高了 NMR 灵敏度，并可测量一系列二维碳-13-碳-13和碳-13-氮-15相关光谱，以分析聚合物的组成、水化、移动性和包装，以整合聚合物，构建细胞壁结构的三维模型。

如果在二D碳-13-碳-13光谱中很难获得对角线信号，则可能发生统计标记。两个碳-13峰值为96和92百万分之一是葡萄糖的特征碳-1信号。因此，在定量碳-13直接极化光谱中，其强度强，回收延迟长达35秒，通常表明小分子由于透析或洗涤不完整而占据主导地位。

使用贴有良好标签的样品，可以进一步测量远距离相关性，以检测生物分子的空间接近性，并构建完整细胞壁的结构模型。该技术允许探索许多天然材料和工程材料的结构功能，促进未来对富含碳水化合物的生物材料和功能化聚合物的研究。由于一些真菌可能导致人类感染或系统疾病，请务必在层流罩中处理真菌材料，以进行保护并尽量减少接触。