这种方法的总体目标是通过允许研究人员记录五个附加标记来询问复杂的细胞群，从而扩展到大多数流动细胞计的光学极限之外。使用这种技术，使用检测器数量小或细胞数量有限的样品时，可以实现深度免疫抑制。通过小心地将抽血转移到 50 毫升锥形管中开始此过程。
在不含有钙和镁的情况下，用等量的PBS稀释血液。将 15 毫升密度梯度介质添加到新的 50 毫升锥形管的底部。小心地将稀释的血液覆盖在密度梯度介质上，避免密度梯度介质和稀释血液之间的任何混合。
在室温下以 400 倍 g 离心 30 分钟，无需制动，以避免界面中断。离心后，使用移液器小心吸气并丢弃上层，注意不要去除等离子体和密度梯度介质之间接口的细胞。从界面收集尽可能多的外周血单核细胞或PBMC，而不接触50毫升锥形管底部的红细胞颗粒，并转移到新的管。
添加 PBS 使最终体积达到 25 毫升，并反转多次混合。然后，将 PBMC 洗涤两次，如文本中所示。去除血小板并计算文本中描述的 PBMC 后，将 PBS 中的细胞重新暂停，0.1% 的亚兹德钠浓度为每毫升 10 倍，达到第七细胞。
要准备用于染色的 PBMC，请将每个样品的 100 微升转移到 96 井 V 底板中。在室温下以 350 倍 g 离心板三分钟。小心吸制上一提液，而不干扰细胞颗粒。
在每一个井，加入100微升PBS含有活/死可修复染料，与蛋白质上的自由胺反应，并仔细重新暂停PBMC混合物。随后，让板在室温下坐10分钟，以标记死细胞。对于每个样品，制备30微升的混合物，包含所有7个抗体。
在这个阶段，对不同目标分子和不同氟化物的滴定抗体也可以添加。在室温下以350倍g将96井板离心3分钟，并小心吸进上一提液，而不会干扰细胞颗粒。将抗体鸡尾酒加入到每个井中，并小心地重新暂停，而不会产生气泡。
在黑暗中室温下孵育30分钟。30分钟后，在每一个井中加入150微升染色缓冲液，并在室温下以350倍g离心，3分钟。小心吸升液，而不干扰细胞颗粒，并在200微升PBS中重新产生细胞。
细胞现在已准备好进行流式细胞测量分析。抗CD3、CD8、CD14、CD19和TCR伽马三角洲抗体以最大染色指数曲线滴定。抗体滴定是该协议中最关键的一步，即使用两个氟化物正确识别七个免疫细胞子集。
要准备双重抗体稀释，请将 96 孔板的 10 孔填充，每孔填充 40 微升染色缓冲液。就本视频而言，仅显示防 CD8 的滴定。在第一个井中，将最终体积增加至80微升染色缓冲液，并添加防CD8的浓度是制造商建议的浓度的四倍。
混合好，将40微升转移到第二个井。混合好，并重复这一步为所有其他井。按照前面证明的协议，用10种不同双倍稀释的10种双倍稀释剂中的30微升将10个PBMC或全血样本染色。
使用流量环测仪获取数据，并绘制每个稀释的信号。计算文本中详述的每个抗体浓度的染色指数后，绘制污渍指数与抗体浓度，以抗体稀释的一小部分表示，并识别具有最大染色指数值的抗体浓度。要滴定抗CD4和抗CD56抗体，首先从前面演示的两倍稀释策略开始，在两者之间添加额外的浓度，以精细地确定允许CD4阳性T细胞和NK细胞与其他细胞群分离的浓度范围。
通过在双CD8阳性、CD3阳性信号和CD3单阳性群体之间放置抗CD4信号，对抗CD4抗体进行滴答。通过将NK细胞置于CD3阴性细胞和CD3阳性群体之间，对抗CD56抗体进行类似策略的滴定。要开始这种双氟色、七标记门控策略，请选择淋巴细胞门，并创建一个点图，其中一个点图与该协议中使用的两个氟圆角之一在每个轴上。
在点图右上角的 CD8 阳性 T 细胞上的门标识为 CD3 和 CD8 双阳性细胞。排除可能包含 NKT 细胞的昏暗 CD8 总体。CD4阳性T细胞的门被确定为CD8阳性T细胞和CD3单阳性细胞之间的种群。
伽马三角洲T细胞的门被识别为高CD3细胞。将伽马三角洲T细胞细分为CD8阳性和CD8阴性。NK细胞的门被确定为CD3阳性和CD3阴性细胞之间的种群。
将 NK 细胞细分为 CD8 阳性和 CD8 阴性。B 单元格上的栅极标识为点图右下角的 CD3 负值 CD19 阳性总体。选择单核门，并创建一个点图，其中两个氟圆在该协议中使用的每个轴上。
CD3 负值、CD14 阳性总体的门。使用这种策略，来自多发性骨髓瘤患者的淋巴细胞根据其向前散射和侧散射及其流动细胞测量轮廓进行封闭。CD8阳性记忆亚细胞和天真T细胞通过CD45RA和CCR7的表达被识别。
HLA-DR 和 CD57 的表达用于研究 CD8 阳性天真、记忆、中央记忆、效应器记忆和效应器记忆 CD45RA 阳性细胞中的 T 细胞激活。以类似的方式，CD4阳性天真和记忆T细胞被识别。在记忆量中，CCR4 和 CCR6 用于识别 CD4 阳性 T 细胞中的 T 帮助器子组。
NK细胞的亚细胞以CD16和CD57表达为特征。这一策略用于研究接受干细胞移植的多发性骨髓瘤捐赠者的纵向样本免疫群的动态。随着时间的推移，CD8和CD4亚细胞的特征显示CD4阳性和CD8阳性T细胞活化，T帮助器向T-帮助器-一个表型倾斜。
但在第60天，B细胞的百分比显著增加，预测患者复发。正确的细胞制备和抗体滴定是使用这种技术实现可靠结果的关键步骤。可以添加针对其他标记的抗体，以完成更深入的流量细胞学分析，并同时创建针对多个血统的模块化流式细胞测量面板。
也可以使用不同的标记集或用于不同的动物模型，以扩大可记录标记的数量的类似方法。不要忘记，阿齐德钠可导致皮肤和眼睛灼伤。因此，在处理这种试剂时，应始终佩戴实验室外套、防护眼镜和手套。
