这种方法可以通过从常规处理活检材料中量化生物标志物蛋白来帮助回答癌症病理学领域关键问题。该技术与传统免疫基础化学相关的主要优点是客观、动态范围广，并允许特定细胞类型的蛋白质定量化。某些所谓的生物标志蛋白的存在或缺失，或者更具体地而言，癌症活检样本中这些蛋白质的相对丰度对于对特定种类的癌症进行特定的病理诊断非常有用。
但它也可以在预测癌症治疗的反应，这就是为什么这种技术是相关的诊断和治疗癌症患者。该协议主要涉及如何在不朽细胞系中使用蛋白质定量来验证免疫荧光分析的定量性质。但需要注意的是，免疫荧光可以很容易地被纳入多路复用方法，并应用于初级活检样本。
协助和演示这一程序将由技术员李·布德劳和运营总监沙克尔·维克担任。两者都来自女王分子病理学实验室。首先，将先前收获的细胞在225 G的50毫升锥形管中离心5分钟。
去光上一提液，将细胞颗粒重新在10毫升PBS中。然后，将重新暂停的电池在225 G下离心5分钟。用 10 毫升 10%NBF 悬浮细胞颗粒。
然后在室温下在摇杆上孵育细胞，在24个RM下过夜。固定细胞后，将细胞在225 G下离心5分钟。然后去除上一除水，在500微升PBS中重新暂停细胞。
将细胞转移到1.5毫升微离心管中，通过离心使细胞产生颗粒。然后，吸上一道。将大约500微升的1%agarose溶液添加到每个含有细胞的管中。
然后，将混合物上下移液混合。在阿加罗斯细胞溶液硬化后，在管中加入10%NBF的毫升。稍后，从样本中删除 NBF。
使用剃须刀刀片卸下电池插头，然后将插头放入塑料纸巾盒中。使用自动组织处理器隔夜处理样品。然后，使用标准组织学方法将样品嵌入石蜡中。
使用组织阵列仪，从石蜡块中收集 6 毫米核心，并将其插入空石蜡块中。在此之后，使用微原子准备新创建的细胞系TMA的两个组织学部分。然后安装组织学幻灯片上的部分，并去仿一些。
首先，将细胞系TMA的两个幻灯片加载到自动染色系统中。用最佳原抗体稀释一侧染色，将另一侧作为阴性控制幻灯片。对两张幻灯片，应用核反面和二级抗体。
染色过程后，加入酪氨酸信号放大试剂。在此之后，使用适当的激发和检测波长扫描使用使用的荧光团的免疫污化幻灯片。使用图像分析软件识别感兴趣的细胞隔间，无论是核还是细胞质，并量化每条线的均度荧光强度或MFI。
为了确定哪个细胞系具有最丰富的靶蛋白，等分培养的细胞将分解成微离心管。然后添加 2.5 微升的 6x 层缓冲液，并加入足够的 RIPA 裂解缓冲液，使总体积达到 15 微升。接下来，用蛋白质梯和先前准备的样品加载 SDS 页面凝胶。
在此之后，将空孔中加载空孔。运行凝胶，直到蓝色染料到达板的底部。执行半干蛋白转移后，使用剃刀刀片水平切割膜，将感兴趣的蛋白质与控制蛋白分离。
根据制造商的说明进行阻断和抗体孵化。然后将膜条放在一个透明塑料袋中。使用 P1000 移液器用 ECL 混合物覆盖膜。
然后密封袋子，在黑暗中室温下孵育膜一到两分钟。接下来，将包含膜的塑料袋放在数字成像平台中。使用化学发光和色度标记检测来捕获膜的各种曝光。
使用图像分析软件或视觉观察，确定哪个细胞系表达最靶向蛋白质。免疫后，该细胞系的连续稀释，使用图像分析软件打开曝光图像。使用矩形选择工具选择凝胶的第一条车道。
然后去分析，凝胶，并选择第一车道。通过将矩形选择工具移动到下一个车道来重复此过程，然后去分析、凝胶并选择下一个车道。接下来，去分析，凝胶，和绘图车道。
使用直线工具在每个峰的基座上绘制线条，以消除背景噪音。然后使用魔杖工具选择每个峰值，然后从结果窗口获取每个峰值的带强度。使用密度测定输出，创建带强度的散射图，与每个主要抗体的总蛋白质量。
然后，使用最佳拟合和视觉观察线来确定每个抗体的线性动态范围的位置。选择在线性范围内产生带强度的蛋白质浓度，并执行所有细胞系的免疫布洛特与该蛋白质浓度，如前面证明。接下来，对数字扫描进行密度测定，选择在每个抗体之前确定的线性范围内产生信号的曝光。
在此之后，计算每个细胞系的目标蛋白带强度与加载控制带强度的比率。最后，使用统计软件在从 IF 染色图像分析中获得的值与从免疫印迹中获得的值之间执行 Pearson 相关测试。该协议用于确认 IF 确定抗凋亡蛋白 Bcl-2 的相对数量的能力。
用免疫功能染色剂在人类扁桃体组织上测试了原抗体的稀释。对于这个实验，1到50的稀释被确定为最优的稀释，产生一个强烈的信号，几乎没有背景噪声。这种稀释用于通过免疫荧光染色细胞系TMA，图像分析用于量化归因于Bfl-2的细胞质Cy5信号。
根据所有测试细胞系的免疫布洛特，Granta-519具有最大的 Bcl-2 丰度。然后，利用格兰塔-519 lysate的序列稀释的免疫布洛特来查找Bfl-2的线性动态范围，并控制蛋白质GAPDH。在此测定中，Bcl-2 的动态范围范围从近 0 的波段强度到 7500 个单位。
GAPDH 的动态范围范围从 3000 到 6500 个单位。在线性范围内的暴露下重复免疫布洛特。并计算了每个细胞系的Bfl-2与GAPDH的比率。
Pearson 相关测试表明，免疫印迹的强度比与定量 IF 的强度读数呈强而正相关。在尝试此过程时，重要的是要记住在多个时间点中暴露最终膜，以便找到所有波段都在其各自线性范围内的最佳曝光。验证 IF 协议的定量性质后，可以在常规处理的组织样本中修改为多路复用 IF，以便回答临床问题，如目标蛋白的表达位置。
