h3 和 h4 组蛋白的纯化及细胞和脑组织中乙酰化组蛋白标记的定量

此方法允许精确定量核心组体 H3 和 H4 及其后转化后修改细胞和组织提取物，从而导致生成高质量、可重复的结果。提出的技术有三大优点。首先，它保留了原生翻译后对组体修饰。

其次，它绕过昂贵的低吞吐量方法。最后，它与下游中通量应用程序完全兼容。证明这个程序将是卡罗琳娜Janczura一个有才华的研究生从我的实验室谁完全优化了这个协议，并采用了这项技术来回答有关在阿尔茨海默病的表观遗传调节的重要问题。

根据文本协议，用适当的细胞培养基在10厘米组织培养处理的培养皿中开始镀块。允许细胞生长，直到达到约90%的汇合。细胞达到所需汇合后，轻轻吸气培养培养素，用预预热无血清介质洗涤细胞两次。

在此之后，从细胞中去除无血清介质，将10厘米的盘子放在冰上。在每个菜中加入一毫升的冰冷萃取缓冲液。使用塑料细胞刮刀收集提取缓冲液中的细胞，并将它们转移到标签为1.5毫升的管中。

然后把管子放在冰上。如果使用冷冻组织，请将组织放在预冷却的1.5毫升管中，并在冰上短暂解冻。接下来，使用推荐的提取缓冲液和中风数量，使用手持式均质器使脑组织均质化。

当没有可见的组织片段和溶液具有乳白色外观时，同质化是完整的。之后，使用单通道1000微升移液器将均质转移到预冷却的1.5毫升管中，然后将管子放在冰上。将含有细胞的管和均质的脑组织放在旋转平台上，在4摄氏度的15 RPM旋转。

在此之后，以最高速度将管在4摄氏度下离心10分钟。接下来，将上一液转移到新的预冷却1.5毫升管中，然后丢弃颗粒。接下来，用1/4体积的中和缓冲液中和组状，然后上下移液混合。

使用 pH 条检查混合物的 pH 值，并根据需要使用中和缓冲液进一步调整 pH。如果酸性血小蛋白在此步骤中和，它们不会正确结合到柱膜上，会通过它，并在流经中检测到。将样品的37.5微升添加到12.5微升的样品缓冲液中。

短暂离心后，混合物在99摄氏度下燃烧10分钟。在此之后，将管子放在冰上，并短暂旋转以收集冷凝水。将样品装载到 SDS-PAGE 凝胶上，以 100 伏运行凝胶一小时。

然后一夜之间弄脏凝胶。并在连续三次洗涤时去污。首先向每个旋转柱添加 500 微升平衡缓冲器。

将柱子离心三分钟。丢弃流经，再重复离心一次。在此之后，将 500 微升的样品添加到列中。

离心柱三分钟，然后收集流经。然后分析列流通，如前所述。向柱中添加 500 微升洗涤缓冲液。

离心柱三分钟，然后收集流经。将柱转移到新标记的 1.5 毫升管。向列中添加 50 微升组蛋白洗脱缓冲区。

离心后，柱保存流包含组蛋白。在化学罩下，在纯化的组度中加入高氯酸，以达到4%高氯酸的最终浓度。移液上下六次混合。

如果样品中的组度非常集中，则在加入高氯酸后溶液将变得浑浊。在此之后，在4摄氏度下孵育管子24小时。如果隔夜组蛋白沉淀成功，离心步骤后，小瓶底部将可见一个小的白色颗粒。

在连续步骤中清洗颗粒时，确保颗粒不会受到干扰，因为它很容易从小瓶底部分离。第二天，将样品在预冷的微离心管中离心75分钟。小心吸制上清液，并在颗粒样品中加入 500 微升冰冷高氯酸。

以最大速度离心样品 10 分钟后，吸进上经剂。在样品中加入500微升的冰冷丙酮，注意不要干扰颗粒。接下来，取出上流液，让管子在冰上干燥30分钟。

然后从冰中去除管子，让样品在室温下干燥五分钟。颗粒干燥后，在30微升无菌水中重新浇水。盖住管子，让石管在冰上重建30至50分钟。

检查颗粒是否重新暂停后，重新取出管子并将其从冰上取出。在该协议中，从人类微胶质BV-2细胞的群化，并分析提取物成分。染色凝胶表明，15分钟至24小时的提取时间不会影响粗组蛋白提取物的整体组成。

通过染色凝胶，分析了组蛋白与柱基体结合的效率。列效率约为 100%，列流中缺乏可检测的组蛋白就证明了这一点。无论提取时间长短，即

15 分钟、2 小时或 24 小时。第一列洗涤从提取物中消除最大的非组蛋白量。与15分钟和2小时的提取时间相比，24小时提取组的纯化组蛋白分数含有更多的H3和H4组蛋白。

第一列洗脱大约100%效率，第二列洗脱缺乏组蛋白就证明了这一点。然后从整个小鼠大脑中提取粗糙的时脑，并测量翻译后修饰。在回应广效的 HADC 抑制剂中，三丁丁林、H4K12 乙酰化在提取物中增加。

然而，由于原油提取物中存在杂质，抗体的特异性降低。使用 I 类和 IIb HDAC 抑制剂 M344 治疗的三生 A/D 小鼠前额皮层完成组蛋白纯化方案，并评估了单个纯核组蛋白分数的 H4K12 乙酰化变化。检测到总组团，并观察到H4K12乙酰化显著增加，以响应M344。

在尝试此过程时，必须记住执行协议中描述的多个检查点，以验证整个过程中成功的结果音纯化。按照这个程序，有关组蛋白磷酸化和甲基化状态的其他问题可以解决。这项技术的发展为我们实验室的研究人员分析阿尔茨海默病的遗传机制铺平了道路。

然而，它可用于各种疾病模型，其中染色质修饰假设发挥重要的作用。