荷尔斯坦奶牛肝线粒体耗氧量和质子泄漏动力学评价线粒体呼吸

这种方法可以帮助回答能量领域的关键问题，如线粒体健康、能量效率和能量使用。该技术的主要优点是直接测量隔离线粒体的耗氧量。结果不需要纠正其他细胞内代谢过程。

当我们想要研究线粒体效率如何影响饲料效率时，我们首先决定在奶牛中采用这种方法。此方法的视频演示至关重要，因为线粒体分离的步骤很难学习，因为它们需要一致和精确。尽快从牛身上取出肝脏样本，在线粒体分离介质中清洗样本，以去除红血球。

使用剪刀将组织细细地切碎成冷藏烧杯，该烧杯含有足够的隔离介质，以保持组织湿润。将切碎的肝脏转移到含有线粒体隔离介质的30毫升玻璃瓶中。加入一个间隙为0.16毫米的特氟龙害虫，在冰中孵育，以500 RPM的小时对肝脏样本进行均质化，每分钟四次。

在此之后，将同质质转移到含有线粒体隔离介质的管中，并放入冰装烧杯中。在500倍G和4摄氏度的离心均质10分钟。丢弃颗粒，将上一液转移到冷却的离心管中。

将产生的上一代在10，000倍G和4摄氏度下离心10分钟，以获得线粒。用无脂肪酸的BSA在10毫升线粒体隔离介质中重新释放和清洗颗粒。然后在8，100倍G和4摄氏度的离心机10分钟。

丢弃上一杯，将颗粒重新在 200 微升隔离介质中。将它放在冰上，直到准备用于氧气消耗和质子泄漏动力学测定。使用 BSA 作为标准，根据制造商的说明，使用双辛辛酸试剂盒确定颗粒悬浮液的蛋白质浓度。

首先，创建文本协议中概述的耗氧介质。在30摄氏度下孵化耗氧介质。接下来，根据制造商的说明，为氧仪系统设置呼吸室、泵和氧电极。

然后将一毫升耗氧介质放入呼吸室。然后向腔室添加0.35毫克线粒体蛋白。大力搅拌，确保溶液与空气饱和，并保持 30 摄氏度的温度。

记录氧气消耗约五分钟。当氧气消耗变为由递减的直线表示的常数时，请记录为基准耗氧量。加入1.25微升的四毫摩尔罗酮溶液抑制复杂一，然后加入五微升的一摩尔吸水溶液，以达到呼吸室中5毫摩尔的最终浓度。

这是状态IV耗氧量。在此之后，加入100毫摩尔ADP溶液的微升，在呼吸室中达到100微摩尔的最终浓度。氧气消耗将减少大约五分钟，然后将成为一条直线。

记录此耗氧量为状态 III 呼吸。计算文本协议中概述的呼吸控制比率。然后从呼吸室中吸出所有溶液。

用双脱水冲洗室几次。首先，准备一个溶液，每毫升尼日尔辛80毫微克在乙醇中限制乙醇添加量小于一微升。此外，在乙醇中准备每毫升寡霉素8微克的解决方案。

用双脱氧水彻底冲洗腔室后，将一毫升耗氧介质放入呼吸室，用磁搅拌棒大力搅拌。向呼吸室添加0.35毫克线粒体蛋白。将甲基三苯磷敏感电极添加到腔室设置中，确保另一端正确连接到 pH 计。

加入1.25微升的四毫摩尔罗泰酮溶液，抑制复杂 I.记录呼吸两到五分钟。记录当氧气消耗值变为常量时。接下来，添加0.56微升的寡霉素溶液，以抑制ADP的利用率。

记录呼吸约两到五分钟。记录当氧气消耗值变为常量时。然后添加0.112微升的80毫微克每毫升尼日尔素溶液，以废除线粒体内膜的pH梯度。

记录呼吸两到五分钟，并记下氧气消耗值时，它变得恒定。在线粒体孵育中加入5个10毫摩尔甲基三甲磷溶液的微升，开始准备标准曲线。重复此添加四次，直到总浓度为 2.5。

已添加微摩尔。在此之后，向腔室添加五微升一摩尔吸华溶液，以开始呼吸。记录呼吸，直到达到稳定的痕迹。

然后添加马龙酸酯来滴定系统，如文本协议中所述。在这项研究中，RCR和质子泄漏动力学在荷尔斯泰因奶牛的牛奶中测量70天后，奶牛已经用不同水平的铜，锌和锰喂养了28天。在锰含量低的奶牛中，国IV呼吸被认为是最高的，但控制性奶牛中却最低，这表明锰在尽量减少质子泄漏依赖呼吸方面起着重要作用。

对肝质子泄漏依赖性呼吸的分析表明，这种呼吸在用低锰治疗的奶牛中是最大的，在控制奶牛中最低。这些结果证实，低锰组具有最大的状态IV呼吸，而对照组有最低。虽然安格斯的饲料效率高于高RFI公牛从低RFI公牛诞生，但并没有反映在线粒体RCR或质子泄漏动力学中。

在执行此过程时，在处理线粒体时，必须将所有小瓶和烧杯放在冰上。该技术开发后，为乳品营养领域的研究人员探索线粒体效率在饲料效率和线粒体功能在肝脏中的作用铺平了道路。不要忘记，使用罗酮可能是危险的，在执行此过程时，应始终采取预防措施，如戴手套、眼睛保护和适当的 PPE。