用水凝胶微室阵列 (HMCA) 板进行肿瘤细胞侵袭和抗转移药物筛选的分析

这种简单的可重复仿生三维细胞系统的目标是促进大量肿瘤球体的入侵能力分析，用于抗转移药物筛查。我们的水凝胶微室阵列的主要优点是，它允许生产大量的均匀球体，填充每井相同的焦平面。即使增加了细胞外基质，水凝胶微室阵列结构也保留了球体位置，从而有助于对球体和入侵过程的精确连续监测。

此外，许多球体和入侵细胞的形态特征和荧光染色可以就地进行，并以单元素分辨率以具有时间效率的方式进行分析。演示水凝胶微室阵列六井成像板生产程序将玛丽亚索博列夫从我们的实验室。要准备水凝胶微室阵列板，首先预热六个聚二甲基硅氧烷（PDMS），将邮票预热至70摄氏度，并在干浴前加热至75摄氏度的干浴上放置一个六孔玻璃底板，预热至75摄氏度，几分钟。

当板是温暖的，倒一个400微升预加热低熔化的阿加糖滴到六井板的每一个井的底部，并轻轻地在每滴上放置一个邮票。让设置在室温下冷却 5 到 10 分钟，随后在 4 摄氏度下冷却 20 分钟，以进行全加糖凝胶。当阿加罗斯凝固后，从每一个井轻轻剥下PDMS，使红糖凝胶与微室图案。

在允许紫外灯达到最高强度后，将浮雕板放在光固化系统中三分钟，用无菌 PBS 填充紫外线消毒的宏井。然后，盖住盘子，用 Parafilm 将其包裹起来，储存四摄氏度，直到使用。要加载电池，请从每一个井上取出 PBS，并轻轻地将 50 微升的感兴趣细胞加载到每个水凝胶阵列的顶部。

在允许细胞通过重力沉淀15分钟后，小心地将6至8个500微升的新鲜介质加入环和水凝胶阵列外的宏井塑料底部边缘。在37摄氏度和5%的二氧化碳中孵育细胞，用于形成球类。然后，将球体转移到冰上的生物安全罩中10分钟。

当板冷却后，将移液器尖端靠在水凝胶阵列旁边的宏井塑料底部边缘，然后从阵列周围取出所有介质。然后，从阵列罐中取下介质，非常小心地将凝胶加载移液器尖端靠在阵列罐的边缘，注意不要打扰微室和球体。接下来，使用预冷冻的细移液器尖端，在阵列边缘添加两个150微升的胶原蛋白混合物，一次一个，慢慢释放混合物，以避免球形错位。

第二轮胶原蛋白被添加到每井后，将球体返回孵化器一小时，以完全凝胶外基质。当基质凝固后，在凝胶顶部加入400微升预加热的1%低熔化黄糖，并在室温下孵育板，在室温下孵育5至7分钟，在4摄氏度下冷却2分钟，进行加糖凝胶化。然后，将移液器靠在大井塑料底部的边缘，轻轻地向每个井添加两毫升的完整介质。

要进行入侵测定，将水凝胶微室阵列板加载到装有37摄氏度和5%二氧化碳培养箱的机动倒置显微镜舞台上，并采用4到10倍的目标预先确定每井中图像采集的位置，以便评估整个阵列区域。然后，每两到四个小时获取一次亮场图像，总共 24 到 72 小时，以跟踪细胞从球体体进入周围细胞外基质的入侵。在图像采集结束时，从图像采集软件导出延时图像，以标记图像文件格式保存到专用文件夹中。

接下来，打开图形用户界面，然后单击"加载亮场"。调整图像的分割参数，实现球体及其入侵区域的精确分割，然后单击"兴趣区域分割"以在每个球体周围创建边框。如果自动分段不正确，请按"删除"或"添加"，然后手动进行相应的更正。

单击"跟踪"可对每个延时图像中的球体进行编号。然后，单击"测量"以生成包含所有参数的电子表格，然后以适当的格式保存电子表格以进行数据处理和统计分析。为了研究透明质酸对自发的 HeLa 球体入侵过程的影响，在本次实验中，用胶原蛋白和透明质酸混合物溶液覆盖了两天成熟的球体，并与单独覆盖胶原蛋白溶液的两天成熟球体进行比较。

经过50个小时的孵育，嵌入在胶原蛋白和透明质酸中的球体与单独嵌入在胶原蛋白中的球体相比，在周围细胞外基质中表现出较低的细胞分散。事实上，对99个球类在单球形分辨率下入侵区动力学的分析表明，在胶原蛋白中加入透明质酸会抑制球状细胞分散，导致入侵区较小。与未处理的 HeLa 球体相比，使用具有细胞和哑激素特性的生物活性类黄酮治疗 HeLa 球类化合物，可对球体周围产生抑制细胞分散。

事实上，在实验结束时对488个球类的入侵区进行分析后发现，治疗后，药物的抑制作用明显，只有10微摩尔。由于水凝胶的附着性较低，这种基于微腔室的技术有助于球体的形成，即使在极少数细胞的情况下。这在宝贵的有限癌症干细胞样或患者衍生的原细胞样本中尤其具有优势。

水凝胶微室成像板允许在长期实验中分析球体的确切空间位置，以在单元素水平上评估入侵过程，并提供高度的统计鲁棒性和准确性。这种方法的未来应用包括并排培养肿瘤和频闪细胞在宏观井内不同区域，以及检索单个球体进行下游分子分析。