Name: fm dye cycling at the synapse: comparing high potassium depolarization, electrical and channelrhodopsin stimulation
Uploaded: 2018-05-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
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我们感谢 Broadie 实验室成员对本文的贡献。这项工作得到了 nih R01s MH096832 和 MH084989 K.B. 的支持, nih predoctoral 研究金 F31 MH111144

1. 幼虫胶解剖
<ol><li>从弹性体套件 (材料表) 中彻底混合10部分硅胶弹性体底座与1部分硅胶弹性体固化剂。</li>
	<li>外套 22 x 22 毫米玻璃盖玻片与弹性体和治疗在一个热板在75˚C 几个小时 (直到不再粘到触摸)。</li>
	<li>将一个单一的弹性体涂层玻璃盖玻片到定制的树脂玻璃解剖室(图 1, 底部), 为幼虫解剖作准备。</li>
	<li>用标准微电极拉拔剂从硼硅酸盐玻璃毛细管中制备胶吸管, 以获得所需的锥度和尖端尺寸。</li>
	<li>轻轻折断微尖端, 另一端附加2英尺的柔性塑料管 (1/32 英寸内径, ID; 3/32 "外径, 外径; 1/32" 墙;材料表)配口管 (P2 吸管尖)。</li>
	<li>填充一个小容器 (0.6 毫升离心管帽) 与小容积 (~ 20 µL) 的胶水 (材料表), 为幼虫解剖准备。</li>
	<li>用生理盐水填充房间 (毫米): 128 氯化钠, 2 氯化钾, 4 氯化镁2, 1 CaCl2, 70 蔗糖和 5 2-[4-(2-羟乙基) piperazin-1 基] 磺酸 (HEPES) pH 值7.2。</li>
	<li>添加抗马萝卜过氧化物酶 (HRP) 抗体共轭到 Alexa 647 (anti-HRP:647; 稀释1:10 从1毫克/毫升股票), 以标记 NMJ 突触前终端在解剖21, 22.</li>
	<li>使用精美的画笔 (尺寸 2), 从食品瓶中移除一个流浪的第三个龄, 并放置在弹性体涂层的盖玻璃上。</li>
	<li>用带有附件的嘴产生的负气压填充玻璃微尖, 用少量胶水 (步骤 1.5)。</li>
	<li>将幼虫背侧与镊子一起放置, 将头部粘附在弹性体涂层的盖玻片上, 用一小滴胶水, 用口正面气压。</li>
	<li>重复这个过程与幼虫的后端, 确保动物在两个胶水附件之间绷紧。</li>
	<li>使用剪刀 (刀片3毫米;材料表), 在后部和垂直切口沿背中线进行水平切口 (~ 1 毫米)。</li>
	<li>使用细钳 (#5,材料表), 轻轻地去除背气管, 肠道, 脂肪体和其他内部器官覆盖肌组织。</li>
	<li>重复四体壁襟翼的胶合过程, 确保在水平和纵向上轻轻伸展身体壁。</li>
	<li>用镊子抬起腹神经线 (VNC), 用剪刀小心地切断马达神经, 然后完全删除 VNC。</li>
	<li>用 Ca2 +-游离生理盐水替换解剖盐水 (与上述解剖生理盐水相同, 没有 CaCl2) 以停止 SV 循环。</li>
</ol>2. 备选案文 1: 高 [K+] FM 染料加载
<ol><li>从 FM1-43 的股票溶液 (4 毫米), 增加1µL 到1毫升90毫米氯化钾溶液 (高 [K+] 在解剖盐水) 为最后浓度4µM。</li>
	<li>使用吸管, 用高 [K+] FM 染料溶液替换成像腔中的 Ca2 +无盐盐水, 以刺激 SV 吞染料的吸收。</li>
	<li>立即启动数字计时器, 以确定高 [K+] 去极化型刺激期间的预定时间(e. g, 5 分钟;图 2)。</li>
	<li>要确认一个健康的幼虫制剂, 请注意在高 [K+] 退极化期的持续时间内肌组织的强烈收缩。</li>
	<li>当计时器周期结束时, 快速删除高 [K+] FM 染料解决方案, 并替换为 Ca2 +-免费生理盐水以停止 SV 循环。</li>
	<li>快速连续清洗与 Ca2 +-免费生理盐水 (5x 1 分钟), 以确保高 [K+] FM 染料解决方案被完全删除。</li>
	<li>在新鲜的 Ca2 +-免费生理盐水中保持幼虫的准备, 以便立即用共焦显微镜进行成像。</li>
</ol>3. 成像: 共焦显微术
<ol><li>使用直立共焦显微镜与40X 水浸泡目标图像 NMJ 染料荧光 (其他显微镜可以使用)。</li>
	<li>图像肌肉 4 NMJ 腹部段 2-4 (其他 NMJs 可以成像) 和收集图像使用适当的软件 (材料表)。</li>
	<li>使用 HeNe 633 nm 激光激发 HRP:647 (带长通滤波器 > 635 nm) 和氩 488 nm 激光器激发 FM1-43 (带通滤波器 530-600 nm)。</li>
	<li>操作确定两个通道的最佳增益和偏移量。 注意: 这些设置在整个实验的其余部分将保持不变。</li>
	<li>采取一个共聚焦 Z 栈通过整个选定的 NMJ 从 HRP 标记的顶端到底部的突触终端。</li>
	<li>仔细注意 NMJ 成像 (段, 侧面和肌肉), 以确保过剩的完全相同的 NMJ 后, 调频染料卸载。</li>
</ol>4. 高 [K+] 刺激: FM 染料卸载
<ol><li>用高 [K+] 生理盐水 (不含 FM1-43 染料) 替换 Ca2 +无盐盐水, 以驱动退极化、SV 胞吐作用和染料释放。</li>
	<li>立即启动数字计时器, 以确定高 [K+] 刺激期间的预定时间 (e. g, 2 分钟;图 2)。</li>
	<li>当计时器周期结束时, 立即删除高 [K+] 生理盐水并替换为 Ca2 +-免费生理盐水以停止 SV 循环。</li>
	<li>用 Ca2 +免费生理盐水 (5x 1 分钟) 快速连续清洗, 以确保完全删除高 [K+] 生理盐水。</li>
	<li>在新鲜的 Ca2 +-免费生理盐水中保持幼虫的准备, 以便立即用共焦显微镜进行成像。</li>
	<li>一定要在相同的 NMJ 上使用相同的共聚焦设置 FM1-43 染料荧光图像。</li>
</ol>5. 备选案文 2: 电刺激调频染料加载
<ol><li>使用微电极拉拔器 (材料表) 准备吸入吸管, 以获得所需的锥度和尖端尺寸。</li>
	<li>用微型锻造将微电极尖端点火, 直到单个马达神经能被紧配合。</li>
	<li>将吸吸管滑入机器人上的电极支架上, 并附着在长柔塑料管和注射器上。</li>
	<li>设置刺激器参数 (e. g, 15 V, 20 Hz 频率, 20 毫秒的持续时间和5分钟 (图 2) 或1分钟 (图 3))。</li>
	<li>在电生理学平台上, 用以上 FM1-43 生理盐水 (4 µM; 1 毫米 CaCl2) 取代 Ca2 +无盐的幼虫制剂。</li>
	<li>将准备工作放在显微镜阶段, 并提高到幼虫和吸吸管的聚焦 (40X 水浸泡目标)。</li>
	<li>吸一圈切断电机神经支配选定的 hemisegment 与负气压的注射器产生的吸入电极。</li>
	<li>在视觉监测所选 hemisegment 的肌肉收缩时, 用短时间刺激来测试吸入电极的功能。</li>
	<li>使用所选参数 (步骤 5.4) 刺激运动神经元, 以驱动 SV 吞和 FM1-43 染料摄取 (图 2)。</li>
	<li>用 Ca2 +无盐 (5x 1 分钟) 快速连续清洗, 以确保 FM1-43 染料溶液完全移除。</li>
	<li>使用上面的共焦成像协议, 在新鲜的 Ca2 +-免费生理盐水中保持幼虫准备。</li>
	<li>仔细注意 NMJ 成像 (段, 侧面和肌肉), 以确保获得完全相同的 NMJ 后, 调频染料卸载。</li>
</ol>6. 电刺激: 调频染料卸料
<ol><li>用常规生理盐水 (无 FM1-43 染料) 替换 Ca2 +无盐生理盐水, 并将制剂放回电生理钻机阶段。</li>
	<li>设置卸载的刺激器参数 (例如、15 V、20 Hz 频率、20毫秒持续时间和2分钟 (图 2) 或二十年代 (图 3))。</li>
	<li>将相同的马达神经吸入到同一个电极上, 然后刺激激活 SV 胞吐作用和 FM1-43 染料释放。</li>
	<li>快速连续洗涤与 Ca2 +-免费生理盐水 (5x 1 分钟), 以确保外部染料完全删除。</li>
	<li>在新鲜的 Ca2 +-免费生理盐水中保持幼虫的准备, 以便立即用共焦显微镜进行成像。</li>
	<li>确保在相同的 NMJ 上使用相同的共焦设置 FM1-43 染料荧光图像。</li>
</ol>7. 选择 3: Channelrhodopsin 刺激 FM 染料装载
<ol><li>在含有 ChR2 因子的全反式视网膜 (溶解于乙醇; 100 µM 最后浓度) 的食物上饲养 ChR2-expressing 幼虫。</li>
	<li>将幼虫制剂放置在有机玻璃室的解剖显微镜阶段, 配备有摄像头端口。</li>
	<li>附上蓝色 LED (470 毫微米;材料表)使用同轴电缆的可编程刺激器, 并将 LED 放到照相机端口。</li>
	<li>利用显微镜变焦功能将蓝色 LED 光束聚焦到解剖幼虫的功能上。</li>
	<li>在 optogenetic 阶段, 用以上 FM1-43 生理盐水 (4 µM; 1 毫米 CaCl2) 取代 Ca2 +无盐的幼虫制剂。</li>
	<li>使用刺激器 (例如、15 V、20 Hz 频率、20毫秒持续时间和5分钟 (图 2)) 设置 LED 参数。</li>
	<li>启动光刺激和跟踪计时器的预先确定的持续时间的 optogenetic 刺激期 (例如, 5 分钟;图 2)。</li>
	<li>当计时器停止时, 请快速删除 FM 染料解决方案, 并替换为 Ca2 +-免费生理盐水以停止 SV 循环。</li>
	<li>用 Ca2 +免费生理盐水 (5x 1 分钟) 快速连续清洗, 以确保 FM 染料溶液完全移除。</li>
	<li>使用上面的成像协议, 在新鲜的 Ca2 +-免费生理盐水中保持幼虫的准备, 以立即成像与共焦显微镜。</li>
	<li>仔细注意 NMJ 成像 (段, 侧面和肌肉), 以确保获得完全相同的 NMJ 后, 调频染料卸载。</li>
</ol>8. Channelrhodopsin 刺激: FM 染料卸载
<ol><li>在解剖显微镜阶段替换 Ca2 +无常规生理盐水 (不含 FM1-43 染料), 并以幼虫为焦点的摄像头端口 LED。</li>
	<li>设置卸载的刺激器参数 (例如, 15 V, 20 Hz 频率, 20 毫秒持续时间和2分钟 (图 2))。</li>
	<li>启动光刺激和跟踪计时器的预先确定的持续时间的 optogenetic 刺激期 (例如, 2 分钟;图 2)。</li>
	<li>当计时器周期结束时, 请快速删除 FM 染料解决方案, 并替换为 Ca2 +-免费生理盐水以停止 SV 循环。</li>
	<li>快速连续洗涤与 Ca2 +-免费生理盐水 (5x 1 分钟), 以确保外部染料完全删除。</li>
	<li>在新鲜的 Ca2 +-免费生理盐水中保持幼虫的准备, 以便立即用共焦显微镜进行成像。</li>
	<li>确保在相同的 NMJ 上使用相同的共焦设置 FM1-43 染料荧光图像。</li>
</ol>9. 荧光定量
<ol><li>加载图像 J (NIH 开源), 并创建一个最大强度投影通过单击图像 |栈 |Z 项目。</li>
	<li>使用 anti-HRP:647 通道, 转到图像 |调整 |阈值和滑动顶部工具栏, 直到只突出显示 NMJ。</li>
	<li>使用魔杖工具, 点击 NMJ。如果 NMJ 不连续, 请按住 Shift 按钮并选择所有部件。</li>
	<li>将图像更改为 FM1-43 染料通道并转到分析 |测量得到荧光测量。</li>
	<li>重复步骤 9.1-9.4 的 "卸载" 图像从相同的 NMJ (确定的部分, 侧面和肌肉)。</li>
	<li>要获得被卸载的染料的百分比, 取被卸载的/被装载的荧光强度的比率。 注意: 可以修改此过程, 以使用 "椭圆形" 或 "徒手" 选择工具, 在溥每溥的基础上进行荧光分析。通过对肌肉荧光的取样可以减去背景荧光。还可以添加代理以减少此背景。</li>
</ol>

作者声明没有相互竞争的利益。

高 [K+] 生理盐水去极化型刺激是迄今为止最容易的三种选择活动相关的 FM 染料循环, 但可能是最小的生理29。这个简单的方法 depolarizes 在整个动物中的每一个可访问的细胞, 所以不允许定向研究。可能在本地应用高 [K+] 生理盐水与微, 但这仍将去极化前/突触细胞和可能突触相关的神经胶质 1.另一个主要关注的问题是高 (K+) 偏极化驱动器快速形成的散装内涵体, 很少看到在静态 boutons。然而, 大块 endosome 形成是一个活跃的机制, 阻止突变29, 表明一个真正的生理过程。因此, 具有高 [K+] 极化的 FM1-43 成像可用于选择性地研究突触中的大块吞。吸入电极电刺激电机神经是一种比较受控制的方法。它的优点是只有单轴突束被刺激, 只有突触前总站直接偏振光 (当然, 肌肉纤维然后偏振光由发射机行动)。因此, 它提供了一个伟大的内部控制 NMJs 在同一动物, 不受刺激。此方法允许您严格控制刺激参数, 不同于高 [K+] 刺激方法, 使与电生理记录4的直接比较。然而, 这种技术需要专门的设备和相当高水平的技术技能, 因此是不容易接近。目标 channelrhodopsin (ChR2) 的光驱动激活具有针对选择神经元30的优势。这种方法不需要熟悉电生理学方法, 而且可以在任何实验室中使用非常便宜的设备, 但是这种方法确实需要对果蝇遗传学有基本的熟悉。
在具有高度可变表型1的遗传条件范围内查询 SV 循环动力学时, 刺激参数的选择至关重要。对于所有方法, 使用的外部 [Ca2 +] 是控制 SV 循环驱动力的关键参数。利用高 [k+] 刺激方法, 一个重要的选择是使用 [k+], 它决定了退极化强度的程度。对果蝇血液的测量表明, [K+] 为5毫米, 而90毫米通常是为活动激发而选择的浓度 (3,7,15,17,31. 但是, 一个 [K+] 范围从30-90 毫米已被使用, 以改变刺激强度5,16,32。另一个关键参数决定是 FM1-43 加载和卸载的高 [K+] 刺激的长度。加载期间确定是否有效地加载了整个循环 SV 填充, 或者仅是活动水泡的子集7。卸载期间同样规定了在刺激期内 SVs 的百分比, 它可以揭示或模糊依赖于 SV 循环频率2的速率变化的突变表型。与吸入电极电机神经刺激, 参数选择还包括刺激电压, 频率, 持续时间和脉搏间隔。世俗模式的活动是 SV 循环动力学的一个关键决定因素7, 不同的刺激方式可以有选择地动员不同的 sv 池。有目标的光驱动 ChR2 激活, 选择包括上述所有 (与光强度变量) 和其他转基因选项在下一节讨论。有了这些参数, 选择就会有更多的实验控制, 但也增加了技术复杂性。
Channelrhodopsin-2 (ChR2) 是一种可渗透到单和价阳离子33的光门控膜通道。如果选择 ChR2 刺激, 有许多选择, 包括 Gal4 驱动程序, UAS-ChR2 构造和光源变量的通道激活。Gal4 驱动程序范围从无处不在到高度具体。例如, 无处不在的 UH1-Gal4 (daughterless) 将在每个单元格中表达 ChR2, 而 CcapR-Gal4 (Janelia) 驱动器 ChR2 在肌肉 6/7 NMJ, 而不是肌肉 4 NMJ31,34。这种选择性可以用作强大的内部控制。有同样许多 UAS-ChR2 变形, 包括 ChR2-H134R (这里使用; 变异的残余导致增加 photocurrents)35, VChR1, 酋长并且更多36。这些通道的每个变体都具有明显的光门、电导、离子选择性、动力学和脱敏特性。注意有些构造包含可能干扰 FM 成像的荧光标记。例如, 这里使用的 UAS-ChR2-H134R 用 mCherry 标记 (前: 587 毫微米, em: 610 毫微米), 但不产生 detectible 发射与 FM1-43 (前: 479 毫微米, em: 598 毫微米) 成像过滤器。技术参数的选择包括光源, 波长和强度的通道激活。这里使用的一个选项是一个廉价的蓝色发光 LED, 通过测定肌肉收缩的刺激视觉证实。我们也成功地激活 ChR2 使用荧光, 虽然扫描共焦激光是不够的。荧光可以用于靶向刺激 (特定的部分, 而不是整个动物), 但刺激参数难以控制, 而 LED 连接到一个简单的刺激器容易改变的时间和频率的光脉冲。聚焦 LED 光通过解剖显微镜相机端口允许更多的控制, 强烈的光刺激。
这是由实验者决定是否离开腹神经线/大脑完整的刺激模式。我们选择删除整个中枢神经系统的三方法比较这里使用, 但有时上游布线保持完好15。一个并发症是, 当神经系统完全离开时, 内源性神经活动就会发生。这种活动的程度从动物到动物的高度变化, 在很大程度上取决于实验者的解剖专长。这种可变活动可能会导致加载和卸载的 FM1-43 染料的数量, 因此不完全是由于使用了15的外源刺激。相关的技术并发症是, 完整的解剖幼虫在虚拟运动中收缩肌组织, 这种位移极大地干扰了 NMJ 成像。如果中枢神经系统被移除, 并且在成像4期间应用 Ca2 +无盐盐水, 则可以减轻这种运动。在这里使用的这些方法足以使优秀的 FM1-43 染料成像在 NMJ 准备。然而, 一些实验者选择添加药物来抑制肌肉收缩(例如,兰尼碱, philanthotoxin-433), 或者使用动作电位阻滞剂 (例如, 河豚毒素) 37, 38.一系列药物可用于选择性地操纵 SV 循环, 以突出某些步骤, 或强调突变体表型来检查神经传递机制。例如, 一些实验者使用了 Veratridine (激活电压门控 Na+通道39), 以增加备用池中的 sv 负载, 环孢素 a (抑制磷酸酶活性40) 以增强 sv 吞, 并佛司可林 (激活 adenylyl 酶41, 它增强了突触传输42), 以增加外/内循环池7,43,44。这种药理操作可以提供更多的洞察力。最后, 根据解剖质量、洗涤效果和刺激方案, FM1-43 背景会发生不同程度的变化。一些添加一个 sulfobutylated 衍生物的β-环糊精 Advasep-745, 或水荧光磺基罗丹明 46, 以淬火非特异性荧光和改善信号-背景比.
有许多技术可以伴随 FM 荧光成像进一步了解 SV 周期 (例如,电生理学, synaptopHluorin, 电子显微学)。这里的例子是 FM 荧光 photoconversion, 用于研究 SV 周期的超微结构细节。SVs 被组织成几个在空间上和功能上截然不同的2的池。易发布池 (RRP) 含有急性刺激后立即释放的囊泡。较大的回收池在适度活动条件下维持 SV 释放。内部储备池 (RP) 只被招募与强 (看似近非生理) 刺激2。激活的 SV 池取决于47使用的刺激类型, 并且使用 FM photoconversion 的果蝇NMJ 报告显示了对这些不同 SV 池48的空间和功能属性的关键洞察。FM photoconversion 可以用来研究在不同的刺激范式下激活的 SV 池, 并查询诸如内涵体和 SVs 之间长期争论的贩运互动的问题 49.如果实验者对 FM 成像感兴趣与其他活动相关的变化在突触, 有据报道的 FM1-43 染料 (FM1-43FX) 的模拟。该探针应允许一个人修复活性相关的染料负载后的果蝇NMJ, 然后跟踪抗体标记, 以测试溥活动水平 (FM 染料荧光) 和活动依赖性表达的相关性蛋白质的兴趣。在未来, 探索其他方法可以使 FM 染料成像与其他成像方法结合在美丽的果蝇NMJ 模型突触上, 这将是非常有益的。

用精美的果蝇幼虫神经肌肉结 (NMJ) 谷氨酸突触模型研究了巨大的基因扰动1的突触形成和功能。运动神经元终端由多轴突分支组成, 各有多个突触 boutons。这些宽敞的静脉曲张 (直径达5µm) 包含所有的神经传递机械, 包括均匀谷氨酸突触泡 (SVs; ~ 40 毫微米直径) 在胞浆储备和容易发布池 2.这些囊泡停靠在突触前等离子膜融合点活性区 (AZs), 胞吐作用介导谷氨酸神经递质释放为反式突触通信。随后, SVs 从等离子膜中提取, 通过接吻和运行回收或网格蛋白介导的吞 (CME) 为重复的外周/吞周期。果蝇NMJ 易于访问, 适合于孤立和表征 SV 周期突变体。利用正向基因筛, 新的突变导致了对 SV 周期3的关键基因的鉴定。而且, 从已经已知的基因开始的反向遗传方法, 通过对突变体循环表型4的仔细描述, 导致了新的 SV 循环机制的澄清。果蝇NMJ 几乎是理想的, 作为一个实验性突触准备, 解剖 SV 吞和胞吐作用机制通过方法, 光学跟踪囊泡循环在神经传递。
一系列荧光标记允许视觉跟踪的水泡在循环动力学, 但最多才多艺的是 FM 染料类似物, 首先合成的毛, F., et al。5. 结构上, FM 染料含有亲水头和通过芳香环连接的亲脂尾巴, 其中心区域赋予光谱性质。这些苯乙烯染料在膜中可逆地分解, 不会在膜小叶之间 "翻转", 所以在细胞质中从来没有自由, 而且在膜中的荧光比水的5还要多。可逆插入脂质双层导致荧光6的40倍增加。在神经元突触中, 经典的调频染料标记实验包括在去极化型刺激过程中, 通过 SV 吞, 沐浴与染料的突触准备。然后将外部染料冲走, SV 循环在无钙的响铃解决方案中被捕获, 以图像加载的突触7。第二轮的刺激, 在无染料浴触发 FM 释放通过胞吐作用, 一个过程, 可随后测量荧光强度下降。从单个囊泡到包含数以百计水泡的水池的 SV 种群可以定量地监视6,7。FM 染料被用来解剖活动依赖的动员功能不同的 SV 池, 并比较亲吻和运行与 CME 循环8,9。该方法已被修改, 以单独检测诱发, 自发和微型突触周期活动 (具有高度敏感的设备, 以检测非常小的荧光变化和减少漂白)10。通过将荧光调频信号 photoconverting 为透射电镜11、12、13、14 的电子密标签, 可以将检测范围扩展到超微结构水平..
从历史上看, 高浓度钾的沐浴突触准备 (以下简称 "高 [K+]") 一直是去极化型刺激诱发 SV 循环的选择方法;从青蛙胆碱能 NMJ5到培养啮齿动物大脑海马神经元15, 到果蝇谷氨酸 NMJ 模型16,17。这种高 (K+) 方法简单, 不需要专用设备, 因此大多数实验室都可以访问, 但对应用程序和数据解释都有限制。一个更加生理上适当的方法是使用吸入电极电刺激神经4,5,12。这种方法推动动作电位的传播, 直接刺激突触前神经终端, 结果可以直接与神经传递功能的电生理学分析,13,14, 15, 但需要专用设备, 技术上更具挑战性。随着光遗传学的出现, channelrhodopsin 神经元刺激的使用具有额外的优势, 包括使用二进制 Gal4/UAS 系统20对信道表达进行严密的时空控制.这种方法在技术上比吸力电极刺激更容易, 只需要一个非常便宜的 LED 光源。在这里, 我们使用 FM1-43 的成像 (N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino) 苯乙烯) 吡啶二溴) 来比较和对比这三种不同的刺激方法在果蝇 NMJ: 简单高 [K + ], 挑战电气和新的 channelrhodopsin 方法。

<table><tbody><tr><td>SylGard 184 Silicone Elastomer Kit</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9644388</td><td>To put on cover glass for dissections</td></tr><tr><td>Microscope Cover Glass 22x22-1</td><td>Fisherbrand</td><td>12-542-B</td><td>To put SylGard on for dissections</td></tr><tr><td>Aluminum Top Hot Plate Type 2200</td><td>Thermolyne</td><td>HPA2235M</td><td>To cure the SylGard</td></tr><tr><td>Plexi glass dissection chamber</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Handmade</td></tr><tr><td>Borosilicate Glass Capillaries</td><td>WPI</td><td>1B100F-4</td><td>To make suction and glue micropipettes</td></tr><tr><td>Laser-Based Micropipette Puller</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-2000</td><td>To make suction and glue micropipettes</td></tr><tr><td>Tygon E-3603 Laboratory Tubing</td><td>Component Supply Co.</td><td>TET-031A</td><td>For mouth and suction pipette</td></tr><tr><td>P2 pipette tip</td><td>USA Scientific</td><td>1111-3700</td><td>For mouth pipette</td></tr><tr><td>0.6-mL Eppendorf tube cap</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-120</td><td>Used to put glue in for dissection</td></tr><tr><td>Vetbond 3M</td><td>WPI</td><td>vetbond</td><td>Glue used for dissections</td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>P-217</td><td>Forsaline</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Millipore Sigma</td><td>S5886</td><td>For saline</td></tr><tr><td>Magnesium Chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>M35-500</td><td>For saline</td></tr><tr><td>Calcium Chloride Dihydrate</td><td>Millipore Sigma</td><td>C7902</td><td>For saline</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-3</td><td>For saline</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Millipore Sigma</td><td>H3375</td><td>For saline</td></tr><tr><td>HRP:Alexa Fluor 647</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>123-605-021</td><td>To label neuronal membranes</td></tr><tr><td>Paintbrush</td><td>Winsor &amp;amp; Newton</td><td>94376864793</td><td>To manipulate the larvae</td></tr><tr><td>Dumont Dumostar Tweezers #5</td><td>WPI</td><td>500233</td><td>Used during dissection</td></tr><tr><td>7 cm McPherson-Vannas Microscissors (blades 3 mm)</td><td>WPI</td><td>14177</td><td>Used during dissection&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>FM1-43</td><td>Fisher Scientific</td><td>T35356</td><td>Fluorescent styryl dye</td></tr><tr><td>Digital Timer</td><td>VWR</td><td>62344-641</td><td>For timing FM dye load/unload&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>LSM 510 META laser-scanning confocal microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td>For imaging the fluorescent markers</td></tr><tr><td>Zen 2009 SP2 version 6.0</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Software for imaging on confocal</td></tr><tr><td>HeNe 633nm laser</td><td>Lasos</td><td></td><td>To excite HRP:647 during imaging</td></tr><tr><td>Argon 488nm laser</td><td>Lasos</td><td></td><td>To excite the FM dye during imaging</td></tr><tr><td>Micro-Forge</td><td>WPI</td><td>MF200</td><td>To fire polish glass micropipettes</td></tr><tr><td>20mL Syringe Slip Tip</td><td>BD</td><td>301625</td><td>To suck up the axon for electrical stimulation.</td></tr><tr><td>Micro Manipulator (magnetic base)</td><td>Narishige</td><td>MMN-9</td><td>To control the suction electrode for electrical stimulation</td></tr><tr><td>Stimulator</td><td>Grass</td><td>S48</td><td>To control the LED and electrical stimulation</td></tr><tr><td>Zeiss Axioskop Microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Used during electrical stimulation.</td></tr><tr><td>40X Achroplan Water Immersion Objective</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Used during electrical stimulation and confocal imaging</td></tr><tr><td>All-trans Retinal</td><td>Millipore Sigma</td><td>R2500</td><td>Essential co-factor for ChR2</td></tr><tr><td>Zeiss Stemi Microscope with camera port</td><td>Zeiss</td><td>2000-C</td><td>Used during channelrhodopsin stimulation</td></tr><tr><td>LED 470nm</td><td>ThorLabs</td><td>M470L2</td><td>Used for ChR activation</td></tr><tr><td>T-Cube LED Driver</td><td>ThorLabs</td><td>LEDD1B</td><td>To control the LED</td></tr><tr><td>LED Power Supply</td><td>Cincon Electronics Co.</td><td>TR15RA150</td><td>To power the LED</td></tr><tr><td>Optical Power and Energy Meter</td><td>ThorLabs</td><td>PM100D</td><td>To measure LED intensity</td></tr></tbody></table>

fm dye cycling at the synapse: comparing high potassium depolarization, electrical and channelrhodopsin stimulation

FM 染料用于研究突触囊泡 (SV) 周期。这些双亲探头有亲水性的头和疏水的尾巴, 使他们水溶性的能力, 可逆进入和退出膜脂双层。这些苯乙烯染料在水介质中相对非荧光, 但插入到等离子膜的外小叶中会导致荧光 > 40X 的增加。在神经元突触中, FM 染料在 sv 吞的内部和之间被内部内化, 并与 sv 胞吐作用一起释放, 提供了一个强有力的工具来可视化神经传递突触前阶段。谷氨酸突触发育和功能的一个主要遗传模型是果蝇神经肌肉结 (NMJ), 其中 FM 染料成像已广泛用于量化 SV 动力学在广泛的突变条件。NMJ 突触终端是容易接近的, 与一个美丽的阵列大突触 boutons 理想的成像应用。在这里, 我们比较和对比三种方法来刺激果蝇NMJ 驱动活动依赖 FM1-43 染料摄取/释放: 1) 浴应用高 [K+] 去极化神经肌肉组织, 2) 吸入电极马达神经刺激去极化的突触前神经终端和 3) 靶向转基因表达 channelrhodopsin 变种为光刺激, 空间控制的退极化。这些方法中的每一个都对研究果蝇NMJ 的 SV 周期的遗传突变效应有好处和坏处。我们将讨论这些利弊, 以协助选择刺激方法, 以及每个战略的具体方法。除了荧光成像, FM 染料可以 photoconverted 电子密集信号可视化使用透射电镜 (TEM) 研究 SV 周期机制的超微结构水平。我们提供的比较共聚焦和电子显微成像的不同方法的果蝇NMJ 刺激, 以帮助指导选择的未来实验范式。

图 1显示了与活动相关的 FM 染料成像协议的工作流。无论后来使用何种刺激方法, 实验总是以相同的幼虫胶解剖开始。图 1a是解剖幼虫的示意图, 显示腹神经线 (VNC)、辐射神经和重复 hemisegmental 肌肉模式。VNC 被删除, 准备沐浴在 FM1-43 的4µM 解决方案中 (图 1b, 粉红色)。然后, 在 FM 染料存在的情况下, 使用三种可能的选项之一, 通过与活动相关的 SV 吞 (图 1cI-III) 加载染料, 从而刺激准备工作。接下来, fm 染料循环使用 Ca2 +-免费生理盐水和一个特定的 NMJ 终端, 已加载 fm 染料成像使用共聚焦显微镜 ("加载图像");图 1d)。在这种情况下, 肌肉 4 NMJ 是选择的示意图显示神经的位置, NMJ 终端分支和 FM 负载突触 boutons。突触准备是第二次刺激使用相同的方法选择上面, 但在没有 FM 染料驱动 SV 胞吐作用和 FM1-43 释放(图 1e)。同样确定的 NMJ (本例中的肌肉 4 NMJ) 然后使用 HRP:647 突触标签和残留 FM1-43 囊泡信号 ("卸载图像") 重新成像;图 1f)。实验者确定加载和卸载阶段的强度和持续时间, 以优化特定检测或突变条件的测量。在加载和卸载后荧光强度是量化的 (图 1d, 1f), 以获取突触染料吞、胞吐作用和释放的 FM 染料的百分比的测量。可以对整个 NMJ 或单 boutons 进行分析。
FM 染料循环可以通过三种方式刺激: 1) 高 [K+] 盐水退极化的整个准备, 2) 吸入电极刺激马达神经, 或 3) 轻驱动活化靶向 channelrhodopsin (ChR2;图 2)。对于所有三种方法的直接并排比较, 我们用每种方法在 FM1-43 (加载) 的情况下进行了5分钟的刺激, 然后在没有 FM1-43 (卸载) 的情况下为2分钟, 并使用相同的共聚焦设置对 NMJs 进行了标记 (图 2)。高 [K] 生理盐水去极化方法遵循广泛使用的 FM1-43 协议的果蝇幼虫 NMJ23, 除了我们使用胶水而不是针的幼虫解剖。这种胶水避免了对显微镜目标的干扰, 并能更精确地测定体壁张力, 但需要适度的学习曲线。所有三种方法都能在 NMJ 突触溥乔木和单个突触 boutons (镶嵌) 内产生强而一致的荧光信号。高 (K+) 盐水退极化方法导致所有 NMJs 在幼虫中被调频加载, 因为它 depolarizes 动物中的每个神经元 (图 2A, 中间)。神经吸力电极电刺激方法仅驱动在幼虫的一个 hemisegment 中, 相应的支配运动神经被刺激 (图 2B, 中间)。同一动物中的静态段可以使用 HRP 标签进行区分, 但不包含可观察到的荧光染料负载, 并作为优良的内部控制。optogenetic ChR2 方法根据所使用的转基因 Gal4 驱动程序产生目标去极化 (图 2C)。在这里, 驱动程序是一个水泡谷氨酸转运器 (vglut) Gal4, 所以所有谷氨酸神经元偏振光的蓝光刺激, 包括所有的谷氨酸运动神经元。因此, 在本示例中, 所有 NMJs 都加载了 FM1-43 染料 (图 2C, 中间)。特定于单元格的驱动程序可用于标记特定的 NMJs, 并使其他人未标记为内部控件。
通过采用与负载染料相同的方法, 实现了调频染料的卸载。在第一种方法中, 幼虫的准备只是沐浴在高 [K+] 生理盐水中没有 FM1-43 到去极化细胞, 驱动器 SV 胞吐作用, 并卸载突触终端 (图 2A, 右)。我们通常选择一个较短的卸载周期 (2 分钟), 所以卸载是部分和终端保持可见的 FM 通道。吸入电极电刺激卸载是相当有挑战性的, 因为它涉及到返回相同的 hemisegment, 识别相同的神经, 并重新刺激神经在没有 FM1-43, 以推动染料卸载 (图2B, 右)。请注意, 染料卸载再次部分。ChR2 卸载需要第二期的蓝色 LED 照明的幼虫准备在没有 FM1-43 激活通道, 去极化运动神经元和刺激 SV 胞吐作用染料释放 (图 2C, 右)。使用此卸载时间刻度 (2 分钟), 这些退极化方法中的每一种都只卸载了负载的 FM1-43 染料的百分比, 在驱动染料释放 (图 2) 中, 高 [K+] 最强和 ChR2 最弱。我们测量了使用的 LED 光强度 (140 µW/毫米2), 它在发布的范围内 (20-1000 µW/毫米2)24,25,26。ChR2 是最大地激活由 ~ 1 兆瓦照明从50-200 兆瓦光源, 以 ChR2 有效性也依赖于 ATR 集中哺养幼虫27,28。因此 , ChR2 的刺激强度可以纵。此外, 与其他刺激力量、时间表或基因型之间的关系可能不存在。如果实验者使用的突变体已经减少了 SV 吞或异常快速的胞吐作用, 那么刺激参数可能需要改变, 以保持一个可观测的信号卸载后。即使在完全没有 FM 信号的情况下, 抗 HRP 标签也允许人们识别 NMJ, 但这并不适合量化。原则上, 卸荷刺激也可能与负载刺激的类型不同。
我们最近研究了分泌突触 deacylase Notum 效应对 SV 周期的损失, 使用电刺激4。在这里, 我们将此分析扩展到比较 1) 高 [K+] 去极化和 2) 吸力电极马达神经刺激方法 (图 3)。我们发现这两种方法都具有相似的结果, 表明在Notum空突变体中 FM1-43 染料的负载减少了;然而, 表型的程度是不同的两种方法。在使用高 [K+] 生理盐水进行五分钟的退极化后, 遗传背景控制 (w1118) 与高级别和Notum null 突变体之间的负载荧光强度大幅下降 (Notum 高 ), 且级别较低 (图 3A, 顶部)。在量化测量中, 在没有 Notum (w1118 1.0 NMJ 0.05 vs Notum 高 0.57 @ 0.07; n≥13, p的情况下, 在 HRP 概述的终端中, 规范化的 FM 荧光强度会显著降低;< 0.0001;图 3B)。在20赫兹的电刺激为1分钟后, 我们发现在量化整个 NMJ 荧光 (w1118 1.0 @ 0.05 vs Notum FM1-43) 时, 控件与Notum null 之间加载的强度显著降低. 0.86 @ 0.06;n = 8, p = 0.10;图 3A, B)。在以溥为溥的基础上测定染料的加入量时, 我们发现两种方法的染料都有显著的下降。在使用高 [K+] 生理盐水刺激后的量化测量中, 每溥的规范化 FM 荧光强度显著降低 (w1118 1.0 0.02 vs Notum 高 0.52 @ 0.02; n≥241, p< 0.0001;图 3C)。电刺激后, 每溥的归一化荧光强度也显著降低, 尽管程度较低 (w1118 1.0 * 0.02 vs Notum 高 0.83 @ 0.02; n≥127, p< 0.0001;图 3C)。
两种刺激模式的结果差异可能是由于许多因素造成的。首先, 与电机神经刺激相比, 高 [K+] 的刺激强度被推定为较大。电生理学录音不能在高 [K+] 盐水存在的情况下进行, 但是幼虫 neuromusculature 明显地被有力地刺激, 因为肌肉收缩是强的和连续的在5分钟沐浴期间。然而, 我们不知道刺激的强度或频率。相比之下, 电刺激更受用户的控制, 选择准确的电压强度和频率的刺激。第二, 与电刺激相比, 刺激持续时间较长 (K+) (图 3)。经过反复试验, 我们选择了1分钟20赫兹电刺激。经过1分钟的染料加载, 有一个强大和可靠的 FM1-43 信号, 所以我们选择了这个范例为我们的研究4, 虽然5分钟的刺激给了一个更强的荧光信号 (图 2)。因此, 刺激范式的长度很可能导致高 [K+] 与电刺激 (图 3B, C) 之间 FM1-43 负载的幅度变化。尽管高 [K+] 方法对Notum突变体显示了更健壮的表型, 但由于更大的控制4, 我们仍然使用了电气方法。控制的强度、频率和持续时间等参数有很多, 必须根据突变体和问题来确定。例如, 刺激方法的选择可能取决于被审问的7的 SV 池, 并且调查了与活动相关的机制10。
在 FM1-43 加载到 NMJ 终端后, 可以使用荧光染料 photoconversion 来产生电子显微成像 (图 4)。在这种方法中, 在 diaminobenzidine (民建联) 的存在下, 染料的制备被暴露在强烈的荧光光中, 而从 FM 染料中产生的活性氧可以氧化民建联以产生暗沉淀 (图 4A)11。请参见朱庇特文章关于 photoconversion 的苯乙烯染料为完整的详细信息12。这种方法的好处是, SVs 在超微结构水平上明显显露出来, 虽然 SV 周期当然是用静态电子显微镜成像来捕获的。在没有刺激的情况下, 在果蝇NMJ 上的突触 boutons 有囊泡 (直径约 40 nm;图 4B), 其中罕见的出现放大器 (>100 nm 直径) 推定为循环内涵体。高 [K+] 生理盐水去极化型刺激强烈改变这个剖面, 与 SV 人口的部分耗尽和大量被扩大的细胞器(> 100 毫微米直径) 的迅速积累被认为从散装获得等离子膜的吞 (图 4C, 左)。虽然静态控制中存在类似的间隔, 但在高 [K+] 生理盐水退极化后, 这些细胞器的高密度会引起人们的关注, 这可能是一种非生理反应。吸入电极电刺激电机神经是相对更有效的消耗 SV 种群, 并没有产生更多的扩大细胞膜泡 (图 4D, 左)。这表明, 由高 [K+] 驱动的大容量吞有助于在更强烈的需求期间维持 SV 种群。
FM1-43 photoconversion 可以使用高 [K+] 生理盐水去极化或吸入电极电刺激马达神经, 比较突触超微结构相对于静止的溥 (图 4)。与高 [K+] 去极化型刺激, 分别 SVs 和扩大的囊泡(> 100 毫微米直径) 可以标记与电子密集的民建联沉淀以下光驱动的 photoconversion(图 4C, 右)。由于不明原因, 放大的囊泡膜通常比较小的 SV 膜密被标记得少。此外, SVs 经常出现的填充与民建联沉淀, 而不仅仅是膜, 但这使得他们更容易区分与未标记的囊泡。随着对电机神经的吸入电极的刺激, 循环 SV 种群也可以标记为相对于未标记 SVs (图 4D, 右)。与电刺激, 扩大的水泡 (>100 毫微米直径) 不是 detectably 形成的在 boutons 并且, 一致地, 假定的内涵体的膜不被 FM1-43 photoconversion 标记。如上所述, 自行车 SVs 通常充满了民建联的沉淀, 在某种程度上是全无或无时尚, 因此更容易区分从 SVs 没有形成在刺激 (图 4D, 右)。在 ChR2 刺激之后, 我们还没有尝试 photoconversion。随着不同时间的刺激过程, FM1-43 染料 photoconversion 允许一个确定 SVs 是在哪里形成的, 如何 SVs 被贩运, 以及在不同的空间池之间的移动时间间隔溥。比较高 [K+] 和神经刺激允许解剖大体积和单 SV 吞机制。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57765/57765fig1.jpg"> 图 1: 在果蝇NMJ 上 FM1-43 染料加载协议的流程图。幼虫胶解剖产生一个扁平的 neuromusculature 准备, 腹神经线 (VNC) 投射节段神经从腹中线 (Vm) 到 hemisegmentally 重复体壁肌阵列 (步骤 a)。VNC 被切开自由, 并且整个幼虫解剖然后孵化在粉红色 FM1-43 解答 (4 µM) 在准备刺激 (步 b)。FM1-43 然后装载以选择的刺激范例 (步骤 3);与所有幼虫 (cI) 的高 [K+] 极化的选择, 吸入电极刺激一个单一的马达神经 (cII), 或光驱动激活高度靶向的 channelrhodopsin (cIII)。FM1-43 注册使用 Ca2 +-免费生理盐水和染料加载 NMJ 映像 (步骤 d)。第二刺激然后做, 不用 FM1-43 在巴恩驾驶染料突触囊胞吐作用 (步 e)。同样的 NMJ, 然后重新成像, 以检测被卸载的突触终端 (步骤 f)。荧光强度的测量从加载和卸载 NMJs, 以量化 SV 吞和 sv 胞吐作用水平。底部面板显示了用于这些研究的透明丙烯酸腔的结构参数和尺寸。<a href="/files/ftp_upload/57765/57765fig1large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57765/57765fig2.jpg"> 图 2: FM 染料加载和卸载所有刺激方法的比较.游荡性第三龄 NMJ 与 1) FM1-43 染料的加载与卸载比较 [K+] 对整个幼体准备 (顶部), 2) 吸力电极电刺激 (中) 和 3) 光驱动的极化激活目标 channelrhodopsin (ChR2) 仅在运动神经元 (底部)。(A) 用 anti-HRP:647 突触前膜标记 (蓝色、左) 标记的幼虫 NMJ, 通过高 [k+] 向5分钟 (中间) 进行极化, 然后通过高 [k+] 去极化2分钟(B) 进行卸载。与吸入电极电刺激具有相同刺激期的 FM1-43 染料的加载和卸载比较。(C) 目标为vglut-Gal4>UAS-ChR2-H134R 在用蓝色 (470 nm) 光激活的运动神经元中的表达式, 用于 FM1-43 染料加载和卸载的相同刺激期。星号指的是插入显示更高的放大倍数 boutons。该秤杆是10µm, 嵌入突触 boutons 扩大3.5X 从主面板。<a href="/files/ftp_upload/57765/57765fig2large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57765/57765fig3.jpg"> 图 3: Notum空突变体显示了突触 boutons 中的调频染料负载减少。FM1-43 加载到徘徊的第三龄 NMJ 的突触终端, 比较遗传控制 (w1118) 到Notum null 突变体 (Notum高)。(A) 在w1118 (左) 和 Notum NMJ (右) 上, 用高 [K+] 对整个幼虫准备 (顶部) 或吸入电极刺激一个马达神经 (底部) 的 boutons 进行了标记。(B) 将每 NMJ 的负载 FM1-43 荧光量化为一个散点图, 比较 w1118 控制与Notum 突变体的高 [K +] 极化和吸入电极刺激。(C) 在溥每溥的基础上量化载入荧光, 作为一个框和晶须图, 比较高 [K+] 极化和吸入电极刺激w1118 控制与NotumKO.学生的双尾 t 测试进行了每个比较与 p 值显示在图表上。酒吧显示的意思是用棱镜制作的 SEM (视窗版本 7.0)。电刺激数据已根据 Kopke et al的允许进行了修改, 开发 144 (19): 3499-510, 2017。<a href="/files/ftp_upload/57765/57765fig3large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57765/57765fig4.jpg"> 图 4: 与 FM 染料 photoconversion 的突触超微结构来标记囊泡.荧光 FM1-43 可以通过透射电镜 (TEM) photoconverted 到氧化 diaminobenzidine (民建) 电子致密沉淀中进行可视化。(A) photoconversion 方法的示意图, 用于在与活动相关的 FM1-43 染料加载后标记果蝇NMJ.(B) wildtype 突触溥在静止 (静态) 的代表 TEM 图像。注意均匀大小的 SVs 的稠密种群 (C) 突触 boutons 的刺激与高 [K+] 生理盐水退极化为5分钟, 没有 photoconversion (左) 或与 FM1-43 photoconversion (右)。注意散装细胞膜结构的存在, 标记和未标记。(D) 突触 boutons, 其电刺激的神经吸力电极在20赫兹5分钟, 无 photoconversion (左) 或 FM1-43 photoconversion (右)。请注意, 染料加载的囊泡看起来比相邻的被卸载的水泡暗得多。<a href="/files/ftp_upload/57765/57765fig4large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本.</a>

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FM Dye Cycling at the Synapse: Comparing High Potassium Depolarization, Electrical and Channelrhodopsin Stimulation

调频染料循环在突触: 高钾偏极化, 电和 Channelrhodopsin 刺激的比较

突触囊泡 (SV) 循环是神经元突触中细胞间通讯的核心机制。调频染料的摄取和释放是定量测定 SV 内胞吐作用的主要手段。在这里, 我们比较所有的刺激方法, 以驱动 FM1-43 循环在果蝇神经肌肉连接 (NMJ) 模型突触。

FM dyes are used to study the synaptic vesicle (SV) cycle. These amphipathic probes have a hydrophilic head and hydrophobic tail, making them ...

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Channels and the Electrical Properties of Membranes

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8.4K 次观看.  Vanderbilt University. 突触囊泡 (SV) 循环是神经元突触中细胞间通讯的核心机制。调频染料的摄取和释放是定量测定 SV 内胞吐作用的主要手段。在这里, 我们比较所有的刺激方法, 以驱动 FM1-43 循环在果蝇神经肌肉连接 (NMJ) 模型突触。

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Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes

The fusion of synaptic vesicles with the plasma membrane (exocytosis) is a required step in neurotransmitter release and neuronal communication. The vesicles are then retrieved from the plasma membrane (endocytosis) and grouped together with the general pool of vesicles within the nerve terminal, until they undergo a new exo- and endocytosis cycle (vesicle recycling). These processes have been studied using a variety of techniques such as electron microscopy, electrophysiology recordings, amperometry and capacitance measurements. Importantly, during the last two decades a number of fluorescently labeled markers emerged, allowing optical techniques to track vesicles in their recycling dynamics. One of the most commonly used markers is the styryl or FM dye 1; structurally, all FM dyes contain a hydrophilic head and a lipophilic tail connected through an aromatic ring and one or more double bonds (Fig. 1B). A classical FM dye experiment to label a pool of vesicles consists in bathing the preparation (Fig. 1Ai) with the dye during the stimulation of the nerve (electrically or with high K+). This induces vesicle recycling and the subsequent loading of the dye into recently endocytosed vesicles (Fig. 1Ai-iii). After loading the vesicles with dye, a second round of stimulation in a dye-free bath would trigger the FM release through exocytosis (Fig. 1Aiv-v), process that can be followed by monitoring the fluorescence intensity decrease (destaining).

Although FM dyes have contributed greatly to the field of vesicle recycling, it is not possible to determine the exact localization or morphology of individual vesicles by using conventional fluorescence microscopy. For that reason, we explain here how FM dyes can also be used as endocytic markers using electron microscopy, through photoconversion. The photoconversion technique exploits the property of fluorescent dyes to generate reactive oxygen species under intense illumination. Fluorescently labeled preparations are submerged in a solution containing diaminobenzidine (DAB) and illuminated. Reactive species generated by the dye molecules oxidize the DAB, which forms a stable, insoluble precipitate that has a dark appearance and can be easily distinguished in electron microscopy 2,3. As DAB is only oxidized in the immediate vicinity of fluorescent molecules (as the reactive oxygen species are short-lived), the technique ensures that only fluorescently labeled structures are going to contain the electron-dense precipitate. The technique thus allows the study of the exact location and morphology of actively recycling organelles.

FM dyes have been of invaluable help in the understanding of synaptic dynamics. FMs are normally followed under the fluorescent microscope during different stimulation conditions. However, photoconversion of FM dyes combined with electron microscopy allows the visualization of distinct synaptic vesicle pools, among other ultrastructure components, in synaptic boutons.

突触小泡池，利用苯乙烯染料的光转化的研究

The fusion of synaptic vesicles with the plasma membrane (exocytosis) is a required step in neurotransmitter release and neuronal communication. The ...

科研

神经科学

Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities

Synaptic vesicles in functional nerve terminals undergo exocytosis and endocytosis. This synaptic vesicle recycling can be effectively analyzed using styryl FM dyes, which reveal membrane turnover. Conventional protocols for the use of FM dyes were designed for analyzing neurons following stimulated (evoked) synaptic activity. Recently, protocols have become available for analyzing the FM signals that accompany weaker synaptic activities, such as spontaneous or miniature synaptic events. Analysis of these small changes in FM signals requires that the imaging system is sufficiently sensitive to detect small changes in intensity, yet that artifactual changes of large amplitude are suppressed. Here we describe a protocol that can be applied to evoked, spontaneous, and miniature synaptic activities, and use cultured hippocampal neurons as an example. This protocol also incorporates a means of assessing the rate of photobleaching of FM dyes, as this is a significant source of artifacts when imaging small changes in intensity.

We describe the use of styryl FM dyes to image synaptic vesicle recycling in functional nerve terminals. This protocol can be applied not only to evoked, but also spontaneous and miniature synaptic activities. The protocol expands the variety of synaptic events that can be effectively evaluated.

使用调频染料诱发过程中，自发的，微型突触活动检查突触囊泡循环的

Synaptic vesicles in functional nerve terminals undergo exocytosis and endocytosis. This synaptic vesicle recycling can be effectively analyzed using ...

Dopamine Release at Individual Presynaptic Terminals Visualized with FFNs

The nervous system transmits signals between neurons via neurotransmitter release during synaptic vesicle fusion. To observe neurotransmitter uptake and release from individual presynaptic terminals directly, we designed fluorescent false neurotransmitters as substrates for the synaptic vesicle monoamine transporter. Using these probes to image dopamine release in the striatum, we made several observations pertinent to synaptic plasticity. We found that the fraction of synaptic vesicles releasing neurotransmitter per stimulus was dependent on the stimulus frequency. A kinetically distinct "reserve" synaptic vesicle population was not observed under these experimental conditions. A frequency-dependent heterogeneity of presynaptic terminals was revealed that was dependent in part on D2 dopamine receptors, indicating a mechanism for frequency-dependent coding of presynaptic selection.

Hui Zhang and Niko G. Gubernator contributed equally to this work.

A new means to measure neurotransmission optically using fluorescent dopamine analogs.

多巴胺的释放突触前货箱码头在个别的可视化与FFNs

The nervous system transmits signals between neurons via neurotransmitter release during synaptic vesicle fusion. To observe neurotransmitter uptake and ...

生物学

TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real time and dissecting the different steps of exo-endocytosis at the single-vesicle level are crucial for understanding synaptic functions in health and disease.
Genetically-encoded pH-sensitive probes directly targeted to synaptic vesicles and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (TIRFM) provide the spatio-temporal resolution necessary to follow vesicle dynamics. The evanescent field generated by total internal reflection can only excite fluorophores placed in a thin layer (&#60;150 nm) above the glass cover on which cells adhere, exactly where the processes of exo-endocytosis take place. The resulting high-contrast images are ideally suited for vesicles tracking and quantitative analysis of fusion events.
In this protocol, SH-SY5Y human neuroblastoma cells are proposed as a valuable model for studying neurotransmitter release at the single-vesicle level by TIRFM, because of their flat surface and the presence of dispersed vesicles. The methods for growing SH-SY5Y as adherent cells and for transfecting them with synapto-pHluorin are provided, as well as the technique&#160;to perform TIRFM and imaging. Finally, a strategy aiming to select, count, and analyze fusion events at whole-cell and single-vesicle levels is presented.
To validate the imaging procedure and data analysis approach, the dynamics of pHluorin-tagged vesicles are&#160;analyzed under resting and stimulated (depolarizing potassium concentrations) conditions. Membrane depolarization increases the frequency of fusion events and causes a parallel raise of the net fluorescence signal recorded in whole cell. Single-vesicle analysis reveals modifications of fusion-event behavior (increased peak height and width). These data suggest that potassium depolarization not only induces a massive neurotransmitter release but also modifies the mechanism of vesicle fusion and recycling.
With the appropriate fluorescent probe, this technique can be employed in different cellular systems to dissect the mechanisms of constitutive and stimulated secretion.

This paper provides a method for investigating neurotransmitter vesicle dynamics in neuroblastoma cells, using a synaptobrevin2-pHluorin construct and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. The strategy developed for image processing and data analysis is also reported.

TIRFM和pH敏感的GFP-探针来评估神经递质囊泡动力学SH-SY5Y神经母细胞瘤:细胞成像和数据分析

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real ...

Loading a Calcium Dye into Frog Nerve Endings Through the Nerve Stump: Calcium Transient Registration in the Frog Neuromuscular Junction

One of the most feasible methods of measuring presynaptic calcium levels in presynaptic nerve terminals is optical recording. It is based on using calcium-sensitive fluorescent dyes that change their emission intensity or wavelength depending on the concentration of free calcium in the cell. There are several methods used to stain cells with calcium dyes. Most common are the processes of loading the dyes through a micropipette or pre-incubating with the acetoxymethyl ester forms of the dyes. However, these methods are not quite applicable to neuromuscular junctions (NMJs) due to methodological issues that arise. In this article, we present a method for loading a calcium-sensitive dye through the frog nerve stump of the frog nerve into the nerve endings. Since entry of external calcium into nerve terminals and the subsequent binding to the calcium dye occur within the millisecond time-scale, it is necessary to use a fast imaging system to record these interactions. Here, we describe a protocol for recording the calcium transient with a fast CCD camera.

Here, we describe a method for loading a calcium-sensitive dye through the frog nerve stump into the nerve endings. We also present a protocol for the recording and analysis of fast calcium transients in the peripheral nerve endings.

通过神经树桩将钙染料加载到青蛙神经末梢:青蛙神经肌肉接头中的钙瞬态登记

One of the most feasible methods of measuring presynaptic calcium levels in presynaptic nerve terminals is optical recording. It is based on using ...

Real-Time Fluorescent Measurement of Synaptic Functions in Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Before neuronal degeneration, the cause of motor and cognitive deficits in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and/or frontotemporal lobe dementia (FTLD) is dysfunction of communication between neurons and motor neurons and muscle. The underlying process of synaptic transmission involves membrane depolarization-dependent synaptic vesicle fusion and the release of neurotransmitters into the synapse. This process occurs through localized calcium influx into the presynaptic terminals where synaptic vesicles reside. Here, the protocol describes fluorescence-based live-imaging methodologies that reliably report depolarization-mediated synaptic vesicle exocytosis and presynaptic terminal calcium influx dynamics in cultured neurons.
Using a styryl dye that is incorporated into synaptic vesicle membranes, the synaptic vesicle release is elucidated. On the other hand, to study calcium entry, Gcamp6m is used, a genetically encoded fluorescent reporter. We employ high potassium chloride-mediated depolarization to mimic neuronal activity. To quantify synaptic vesicle exocytosis unambiguously, we measure the loss of normalized styryl dye fluorescence as a function of time. Under similar stimulation conditions, in the case of calcium influx, Gcamp6m fluorescence increases. Normalization and quantification of this fluorescence change are performed in a similar manner to the styryl dye protocol. These methods can be multiplexed with transfection-based overexpression of fluorescently tagged mutant proteins. These protocols have been extensively used to study synaptic dysfunction in models of FUS-ALS and C9ORF72-ALS, utilizing primary rodent cortical and motor neurons. These protocols easily allow for rapid screening of compounds that may improve neuronal communication. As such, these methods are valuable not only for the study of ALS but for all areas of neurodegenerative and developmental neuroscience research.

Two related methods are described to visualize subcellular events required for synaptic transmission. These protocols enable the real-time monitoring of the dynamics of presynaptic calcium influx and synaptic vesicle membrane fusion using live-cell imaging of in vitro cultured neurons.

肌萎缩性侧索硬化症模型中突触功能的实时荧光测量

Before neuronal degeneration, the cause of motor and cognitive deficits in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and/or frontotemporal lobe ...

Live Imaging of Synaptic Vesicle Recycling in the Neuromuscular Junction of Dissected Larval Zebrafish

Neuronal communication is mediated by synaptic transmission, which depends primarily on the release of neurotransmitters stored in synaptic vesicles (SVs) in response to an action potential (AP). Since SVs are recycled locally at the presynaptic terminal, coordination of SV exocytosis and endocytosis is important for sustained synaptic transmission. A pH-sensitive green fluorescent protein, called pHluorin, provides a powerful tool to monitor SV exo/endocytosis by targeting it to the SV lumen. However, tracking AP-driven SV recycling with the pHluorin-based probes is still largely limited to in vitro culture preparations because the introduction of genetically encoded probes and subsequent optical imaging is technically challenging in general for in vivo animal models or tissue preparations. Zebrafish is a model system offering valuable features, including ease of genetic manipulation, optical clarity, and rapid external development. We recently generated a transgenic zebrafish that highly expresses a pHluorin-labeled probe at motor neuron terminals and developed a protocol to monitor AP-driven SV exo/endocytosis at the neuromuscular junction (NMJ), a well-established synapse model that forms in vivo. In this article, we show how to prepare larval zebrafish NMJ preparation suitable for pHluorin imaging. We also show that the preparation allows time-lapse imaging under conventional upright epifluorescence microscope, providing a cost-effective platform for analyzing NMJ function.

The zebrafish larval neuromuscular junction is an attractive model for studying synaptic physiology. It is amenable to many experimental techniques, including electrophysiology and optical imaging. Here, we describe a protocol for imaging synaptic transmission using a pHluorin-based probe under an upright epifluorescence microscope.

解剖斑马鱼幼鱼神经肌肉接头突触囊泡循环的实时成像

Neuronal communication is mediated by synaptic transmission, which depends primarily on the release of neurotransmitters stored in synaptic vesicles (SVs) ...

天然骨骼肌细胞中的功能性定点荧光测定

Functional Site-Directed Fluorometry in Native Cells to Study Skeletal Muscle Excitability

Functional site-directed fluorometry has been the technique of choice to investigate the structure-function relationship of numerous membrane proteins, including voltage-gated ion channels. This approach has been used primarily in heterologous expression systems to simultaneously measure membrane currents, the electrical manifestation of the channels&#39; activity, and fluorescence measurements, reporting local domain rearrangements. Functional site-directed fluorometry combines electrophysiology, molecular biology, chemistry, and fluorescence into a single wide-ranging technique that permits the study of real-time structural rearrangements and function through fluorescence and electrophysiology, respectively. Typically, this approach requires an engineered voltage-gated membrane channel that contains a cysteine that can be tested by a thiol-reactive fluorescent dye. Until recently, the thiol-reactive chemistry used for the site-directed fluorescent labeling of proteins was carried out exclusively in Xenopus oocytes and cell lines, restricting the scope of the approach to primary non-excitable cells. This report describes the applicability of functional site-directed fluorometry in adult skeletal muscle cells to study the early steps of excitation-contraction coupling, the process by which muscle fiber electrical depolarization is linked to the activation of muscle contraction. The present protocol describes the methodologies to design and transfect cysteine-engineered voltage-gated Ca2+ channels (CaV1.1) into muscle fibers of the flexor digitorum brevis of adult mice using in vivo electroporation and the subsequent steps required for functional site-directed fluorometry measurements. This approach can be adapted to study other ion channels and proteins. The use of functional site-directed fluorometry of mammalian muscle is particularly relevant to studying basic mechanisms of excitability.

作者聚焦：天然细胞中的功能性定点定向荧光测定法研究骨骼肌兴奋性  

Functional site-directed fluorometry is a method to study protein domain motions in real time. Modification of this technique for its application in native cells now allows the detection and tracking of single voltage-sensor motions from voltage-gated Ca2+ channels in murine isolated skeletal muscle fibers.

天然细胞中的功能性定点荧光测定法，用于研究骨骼肌兴奋性

Functional site-directed fluorometry has been the technique of choice to investigate the structure-function relationship of numerous membrane proteins, ...

调频染料循环在突触: 高钾偏极化, 电和 Channelrhodopsin 刺激的比较

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突触小泡池，利用苯乙烯染料的光转化的研究

使用调频染料诱发过程中，自发的，微型突触活动检查突触囊泡循环的

多巴胺的释放突触前货箱码头在个别的可视化与FFNs

TIRFM和pH敏感的GFP-探针来评估神经递质囊泡动力学SH-SY5Y神经母细胞瘤:细胞成像和数据分析

通过神经树桩将钙染料加载到青蛙神经末梢:青蛙神经肌肉接头中的钙瞬态登记

肌萎缩性侧索硬化症模型中突触功能的实时荧光测量

解剖斑马鱼幼鱼神经肌肉接头突触囊泡循环的实时成像

天然细胞中的功能性定点荧光测定法，用于研究骨骼肌兴奋性

天然细胞中的功能性定点荧光测定法，用于研究骨骼肌兴奋性

天然细胞中的功能性定点荧光测定法，用于研究骨骼肌兴奋性