矩阵辅助激光去离子成像质谱法显示人脑中的淀粉样β矿床

本文的主要贡献是，我们利用 MALDI 成像质谱仪的成像技术，探索了阿尔茨海默病大脑淀粉样β病理学的精确而精细的景观。我们通过生成一种特殊的协议，对组织幻灯片进行甲酸预处理，从而取得了技术进步。在 MALDI-IMS 之后，生成分段图并进行计算，以发现与斑块和亚巴奇内血管结合的新标记蛋白或肽。

从脑部获取 IMS 的人体皮质标本，这些样本在死后 8 小时内被移除、处理并储存在零下 80 摄氏度。从AD患者的腹皮层和年龄匹配的对子控制的大脑标本。要切割低温恒温器上的组织部分，首先将导电氧化锡或 ITO 涂层显微镜玻璃在低温恒温器内滑动。

将低温恒温内检测脑标本从零下80摄氏度加热至零下22摄氏度。每次实验时，在低温恒温器上附加一个新的一次性刀片。始终尽量使用刀片的清洁部分。

将冷冻的解剖大脑与少量最佳切割温度化合物一起放在舞台上。对于 IMS 和免疫组织化学，从每个组织样本中切下 5 到 6 个部分。当刀片刚刚开始切割组织时，转动车轮并面对方块，直到所有组织都暴露。

如果该部分有小条纹或撕裂，请等待低温恒温器，直到温度调整自动修复它。在打开下面有纸巾的防卷之前数数几秒钟。立即将组织切片放在玻璃幻灯片的 ITO 涂层侧。

将手指放在非 ITO 涂层侧的幻灯片下方，解冻组织切片。组织将粘在幻灯片上。确保组织尽可能平整，无皱纹。

要冲洗组织部分，将样品浸入40至100毫升70%乙醇中，在玻璃染色罐中浸泡30秒，以去除内源性脂质和无机盐。使用文本协议中列出的洗涤顺序清洗样品。然后，在真空中干燥样品30分钟。

现在，用甲酸蒸汽治疗组织部分，以更好地从解剖脑组织中电离淀粉样β蛋白。为此，在60摄氏度下准备烤箱和一个孵化玻璃盘，5毫升100%甲酸。将孵化玻璃盘中的空气湿度保持饱和。

将组织滑梯放在孵化玻璃盘中，同时避免在甲酸中淹没，并治疗6分钟。使用胶片扫描仪、凝胶扫描仪或数字显微镜拍摄样品的光学图像。在室温下执行此步骤。

当样品目标放置在仪器内时，样品的光学图像必须对齐。通常，无法识别基质层下方的组织部分。要将光学图像与样本关联，请制作在光学图像和相机光学矩阵层下方可见的引导标记。

最简单的方法是在拍摄光学图像之前，在样品周围至少发现三个校正流体标记。要用超声波喷雾器喷洒基体，请从干燥器上取出要喷洒的组织并将其放在腔室中。确保组织未覆盖传感器窗口。

按下"开始"按钮开始准备。通常，准备时间约为 90 分钟。通过监测基质层厚度和湿润度，自动调节制备。

或者，使用自动喷雾器将基质溶液喷洒在组织表面上，请使用设置为每分钟 10 psi 和 0.15 毫升的溶剂泵系统来提供基质溶液。与基体溶液喷雾剂会联合提供恒定的加热护套气体。使用 MALDI-IMS 进行高通量和高空间分辨率成像实验。

对于质谱测量，使用 MALDI 控制软件和数据分析软件定义组织区域。以正线性模式获取光谱，质量与电荷比范围为 2，000 至 20，000，空间分辨率为 20 和 100 微米。要制定校准标准，使用CHCA和TA30溶液将肽校准标准和蛋白质校准标准以一比四的比例溶解，然后稀释10次。

在四个不同位置将校准标准的微升放在幻灯片上。使用分子组织学软件，叠加多个信号图像，以找到各种信号的空间相关性，如不同的淀粉样β肽在老年斑块和动脉壁中成类科洛。脑淀粉样血管病或三号患者的CAA表型在这项研究中最为突出。

该患者的脑组织的 MALDI-IMS 清楚地显示淀粉样β 1-42 和淀粉样β 1-43 被优先沉积为脑帕伦奇瘤中的老年斑块。相比之下，较短的淀粉样β，如淀粉样β1-36至1-41被优先沉积在钩端蛋白血管区域。非病理控制中没有重大信号。

淀粉样β1-40和淀粉样β1-42的分布得到进一步验证与免疫组织化学使用相邻的冷冻部分的组织。标有CAA的抗淀粉样β1-40抗体和揭示淀粉样β1-40优先沉积在钩端蛋白脑血管中，这与淀粉样β1-42在脑膜膜中作为老年斑块的分布形成鲜明对比。此处显示的是通过从患者编号 3 应用于同一部分的一分为二 k-means 分析获得的分段图。

这种聚类方法成功地识别了亚半地空间中斑块状结构和血管结构。有趣的是，在帕伦奇玛找到一个小的圆形区域，这是检测只是周围的一个小动脉在帕伦奇马以及在亚巴拉奇空间。这通过这些个体淀粉样β肽的单离子图像得到验证。

即使使用特定的抗体，同时追踪广泛淀粉样β也有限制。在这里，我们使用尖端的 MALDI 成像质谱法，展示淀粉样β在人脑中的分布。我们相信这一贡献在阿尔茨海默病研究上取得了突破，因为这份报告提供了人类中全集淀粉样β蛋白的特征。

最令人印象深刻的发现是，淀粉样β蛋白的C端只有一个氨基酸的改变，使得它们的分布发生了剧烈的变化。组织准备步骤对于获得人类脑组织中聚合蛋白的有效电离至关重要。分析材料与基质的均质共结晶化对于高灵敏度和无伪影成像至关重要。