Name: anatomically inspired three-dimensional micro-tissue engineered neural networks for nervous system reconstruction, modulation, and modeling
Uploaded: 2017-05-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
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财政支持由美国国立卫生研究院U01-NS094340（Cullen），T32-NS043126（Harris）和F31-NS090746（Katiyar）提供），Michael J.Fox基金会（治疗管道计划＃9998（Cullen））， Penn医学神经科学中心试点奖（Cullen），国家科学基金会（研究生研究奖学金DGE-1321851（Struzyna和Adewole）），退伍军人事务部（RR＆D优异评估＃B1097-I（Cullen）），美国协会的神经外科医生和神经外科医生大会（2015-2016 - 神经损伤与重症监护（Petrov）Codman研究金）和美国陆军医学研究和物资司令部（＃W81XWH-13-207004（Cullen）和W81XWH-15-1- 0466（Cullen））。

作者没有什么可以披露的。

CNS损伤和疾病通常导致构成脑连接的长途轴突途径的丧失或功能障碍，伴有或不伴有神经元变性。由于中枢神经系统有限的能力来促进神经发生和再生，所以复合化。尽管追求修复策略，如生长因子，细胞和生物材料传递作为个体或组合方法，这些技术不能同时解释神经元细胞的退化和轴突连接的损失14,22。技术上的这些差距限制了以受控和持续的方式修复，改变和探测神经网络的能力。因此，微型TENN技术被开发以解决对神经修复策略的需要，与现有方法相比，促进神经元替换和长轴突连接的重建。话筒ro-TENNs是可植入的生物支架，具有预先形成的细胞结构，其接近专门设计用于宿主神经回路的靶向重建，替换和修饰的大脑连接体的系统级构建块。这些支架由微小圆柱形琼脂糖水凝胶的含ECM腔内的长轴突束连接的离散群体组成。这些构建体可能能够用作突触中继来代替丢失的途径并动态调节本机电路。另外，在孤立的轴索变性（源神经元保持完整）的情况下，微TENN可能作为轴突再生的指导，基于轴突促进轴突再生的机制。该手稿提出了制造协议，以可靠地创建具有受控几何，表型和功能特征的微型TENN。相差显微镜，免疫细胞化学Stry和共聚焦显微镜证实，用方案产生的微TENNs显示所需的细胞结构并表达突触前蛋白突触蛋白。此外，显示出在不存在外部模拟的情况下，微TENN具有固有的信号传导活动，可能是由于动作电位引起的。这是通过存在与遗传编码的钙记者相关的荧光的近同步波动来确定的。 微型TENN开发可以通过三个步骤来总结:（1）中空水凝胶管的制造，（2）将ECM溶液加入到管腔中，和（3）将分离的神经元的聚集体接种到管端。微柱可以用玻璃毛细管或含有圆柱形通道的微制造装置制造。该设备可以用调查员可用的任何高精度微制造方法创建。液体将琼脂糖倒入装置的通道或装入含有中心针刺针的毛细管中以产生水凝胶微柱。在琼脂糖胶凝后，取出针刺针以产生中空管腔。在制造或生长过程中发生的几个常见的陷阱在图8中突出显示。注意， 图4中显示的一些图像和图8B中的极端情况示出了腔体部分不稳定地靠近圆柱体的壁。为了在使用毛细管法时产生均匀的壁厚，当与琼脂糖接触时，管针组件应保持直立，并且针应保持在管的中心。保持管 - 针组件相对于琼脂糖表面成一定角度，促进针的分散。然而，这些预防措施难以实施，而针头通常不是休息的阿隆g毛细管的壁。相反，微型装置的主要优点是它具有与圆柱形通道同心对准的针孔，从而分别促进针和管腔相对于通道和微柱的适当集中。此外，该装置通过促进同时制造几个微柱来增加产量。尽管设备提供了好处，但是仍然可以通过使用弯针针来创建离心腔。微制造技术也具有限制其有效性的内在宽容。通常，如果遵循整个协议中提供的建议，微柱脱水对图8A中显示极端情况的影响不应该是一个障碍。请注意，用于外包裹的琼脂糖的物理性质可能需要优化替代神经元亚型，因为改良的皮层神经元观察到较高（3-4％）和较低（1-2％）琼脂糖浓度的尿毒素和神经突生长10 。 微型TENN开发继续将ECM引入微柱腔，其用于提供足够的神经元粘附，存活和生长的环境。此外，ECM与由琼脂糖水凝胶提供的几何限制和低孔隙结合限制轴向长度方向的生长以产生必要的结构。 ECM解决方案的内容可以针对所用神经元的类型进行优化。例如，胶原单独促进DRG微TENN中的存活和轴突生长，而皮质神经元10需要胶原和层粘连蛋白的组合。此外，在细胞培养之前，微柱内的ECM聚合是关键的，因为具有未聚合的ECM的细胞的共同递送导致减少的神经突出现owth和fasciculation 31 。注意，即使微柱最初填充有ECM溶液，其内含物聚合成软凝胶，并且在孵育期间趋于收缩，形成允许插入细胞聚集体的空间。此外，重要的是通过立体镜检查来确认ECM进入微柱内部;丢失的ECM的完全缺失和/或口袋结构导致聚集体缺乏轴突生长。微型TENN制造最终导致了脚手架极端皮层神经元聚集体的种植。使用已知方法48从大鼠胎儿解剖这些神经元。可以推断，大多数分离的细胞是神经元，因为用于分离的妊娠时期的胚胎大鼠皮质由99％的神经元组成，并且方案中使用的限定的培养基是代谢限制胶质细胞增殖<html> 49 。因此，应该有最小的胶质细胞污染，尽管特定标记物的染色需要确认。虽然本手稿提供了具有皮层神经元的微TENN制造，但是可以根据期望的应用使用来自不同脑区域（ 例如黑质，丘脑和海马）或具有不同表型（ 例如兴奋性，抑制性和多巴胺能）的神经元植入面积微型TENN制造方案的先前迭代涉及种子解离细胞10,31,32。虽然使用解离法获得了所需的细胞结构，但是在所有情况下都没有实现。在许多情况下，分离的细胞淹没了内部，并导致整个管腔中的几个细胞体团簇，其中过程将它们连接在广泛的3D网络参考文献10,31，另一方面，聚合方法确保细胞体到极限的存在，因此是微型TENN技术成功的组成部分（ 图5 ），代表性的微型TENNs显示如图8D和8E所示，与图8D和8E所示的实施例相比， 图4-6中制备的聚集体较大，未完全插入，有时会导致聚集体从培养基中的微柱脱落，为了防止这种情况，完全插入微柱内部，如果在应用以前的策略后仍然出现这种情况，可以延长初始孵化期，为ECM提供足够的时间聚集，在培养过程中，微量TENN的温和处理是建议保持水凝胶包裹和细胞结构的完整性;微T期间的问题ENN操作是否定方向的轴突束获得的曲率的原因（ 图5 ）。然而，按照本文中提出的方案，应该导致具有预期神经元/轴突结构，突触前bouton分布和固有电活动的微TENN的一致制造。 尽管微型TENN承诺，仍然存在可能限制该技术应用的挑战。目前的微柱制造技术受到微柱腔分散的限制，这可能导致机械线索对细胞（ 例如刚度）的不一致呈现，微柱壁的破裂和随后的轴突束暴露到外部，以及植入期间的问题。尽管与毛细管相比，微制造装置的使用提高了结果，但是更高精度的微观结构需要n种技术来增加这些构建体的尺寸再现性。该手稿的结果表明，微TENN方法可以可靠地产生由神经元和轴突区组成的生物支架，其类似于天然神经解剖学，特别是连接不同脑区的轴突区。然而，微TENN长度是一个障碍，取决于需要替换的宿主轴突途径的长度。例如，组织工程神经移植物（TENGs）是我们的研究小组利用的单独的生活支架策略来修复极长的神经损伤。为了取代这些长间隙，通过在定制的机械生物反应器1，23，50中施加连续的机械张力，TENG中的轴突可以延长到几十厘米。这种"拉伸生长"技术也被应用于操纵星形胶质细胞过程长度r模拟径向胶质细胞通路的结构51 。相反，目前的微型TENN技术还没有提供这种程度的控制;目前，最大可达到的长度受限于基于传统的生长锥介导的延伸，轴突束可以在体外生长多长时间。此外，即使CNS具有响应于各种刺激的神经生理重新布线的内在能力，并且移植的细胞具有与天然电路突触整合的能力，该技术的另一个限制是微TENN依赖于天然大脑的可塑性以及主机网络与植入的构建体52,53,54,55功能地整合的能力。最后，所有基于种植体的方法（如微型TENN）的天生缺陷是其侵入性。由于神经元是通常在紧密的毛细血管附近，任何类型的外科手术都可能导致血脑屏障破裂，血液因子渗入脑实质，以及急性（甚至慢性）炎症反应31 。这种反应可能会损害宿主和微型TENN神经元，抵消了这种技术的有益方面。然而，植入大鼠皮质丘脑途径的微TENNs存活至少1个月，并显示与主体大脑皮层10,31结构整合的证据。此外，我们研究组的以前的出版物提出了一种方法，可以将微TENNs无针入植入大鼠脑31 。在这种方法中，这种水凝胶包装策略得到增强，包括一个薄（〜20μm）的羧甲基纤维素涂层，在轻度脱水后，呈现足够的硬度穿透大脑不需要针或引导件31 。这种无针注射方法与微柱的小横截面相结合，应尽可能减少立体定位植入过程中和之后对脑的损伤。 尽管微型TENN 在体内取得了初步的成功，但未来的研究将需要证实这些结构与天然组织突触整合，并调查是否在CNS损伤和神经变性疾病模型中获得功能恢复10,31。例如，定制的微型TENN可以被设计成具有特定的细胞表型并植入到相应的退化途径中以重建网络并恢复功能。为了减少植入后的急性炎症反应，微TENN水凝胶外壳可掺杂有抗炎和预存的试剂。替代制作可以开发技术（ 例如， 3D打印）以更容易地产生水凝胶微柱，并具有更精确的特征，包括内腔的一致集中和尺寸的再现性。可以修改与微TENN相同的生物材料方案，以解决CNS损伤和疾病的其他特征性病理。例如，我们的团队以前已经开发出包括纵向排列的星形胶质细胞束的构造，沿着胶原包被的琼脂糖水凝胶腔，结构上模拟径向胶质通道和胶质管以促进轴突再生和神经元迁移。另外，干细胞，如人类胚胎干细胞（HESCs），诱导多能干细胞（iPSCs）和脂肪来源的干细胞（ASCs），可以纳入每个患者的基础上制造自体微TENN更多非常类似于丢失的细胞结构和细胞表型。这些futu重新修改将增加微TENNs 在体内取代退化途径的能力，并且将允许重建更复杂的组织结构，结合星形胶质支持和轴突髓鞘形成以及其他特征。基因工程神经元也可以接种，以通过释放营养因子来增强微型TENN的再生作用，或通过光门控离子通道43的光生刺激来调节CNS。这些支架可以用兴奋性或抑制性神经元制造，以在诸如癫痫，抑郁症，药物成瘾或疼痛障碍的病症中突触调节现有的功能障碍宿主连接1 。例如，可以构建主要形成GABA能或谷氨酸能突触的微型TENN，以分别抑制或刺激通过突触整合和/或通过体神经的上调或下调通路o发射器释放。重要的是，这种自包含的调制结构在理论上将是基于主机网络反馈的响应1 。类似地，微TENN可以作为脑 - 计算机接口（BCI）应用，光电工程微型TENN用作大脑和无机刺激或记录装置之间的中间体。该应用可以是微电极BCI的替代物，其缺乏特异性细胞靶向和机械稳定性并且已经引起炎症反应，胶质瘢痕形成以及当渗入脑中时的神经元迁移或损失57,58 。 作为体外试验台，微型TENN可为神经生物学和电生理学研究提供强大的平台，作为神经系统的生物传感模型。另外，当用作神经注射时，3D构造可用作治疗策略的试验台尿病模型59 。作为3D构造，微型TENN能够模拟体内环境，其特征在于在所有空间方向上的复杂的细胞 - 细胞和细胞 - ECM相互作用，其不能在平面培养物42,60,61,62,63中精确表示， 64,65 。事实上，许多研究已经确定，环境的类型对于细胞呈现在天然植物中呈现的形态，增殖，迁移，基因表达，分化和信号是至关重要的。这些支架的3D环境与大脑本身之间的相似之处在于这些构造物对其物理和生物化学物质的控制程度的补充操作42 。这允许使用不同组的机械，触觉和趋化性信号对微TENN进行工程化，以单独或协同地研究这些线索对神经元存活，成熟，轴突延伸，突触形成和机械转导的影响。此外，这种微组织工程技术的设计灵活性允许构建模仿脑组织的其他特征的生物支架，例如由连接体的轴突区跨越的新皮层的柱状，分隔的结构，以进一步增加这个系统的力量作为体外平台来研究大脑65 。作为研究平台，微型TENN利用典型体外模型的受控设置，组织中设计参数的广泛可用性Gineering方法，以及3D平台增加的生理和病理生理相关性，成为推进神经生物学知识的理想测试床。该技术的无数未来发展方向代表了微型TENN的多功能性。该手稿已经证明，微型TENN协议可以可靠地生产组织工程生物支架，其模拟脑神经解剖学的关键特征，为神经生物学现象，包括发育，疾病和修复过程提供新的见解。这些构建体还可以与天然组织突触整合以重建损伤的白质块，替代丢失的神经元细胞，并调节CNS损伤和疾病之后的失调途径。

中枢神经系统疾病和疾病（CNS）的常见特征，如创伤性脑损伤（TBI），脊髓损伤（SCI），中风，阿尔茨海默病和帕金森病，是轴突途径和神经元细胞的断开损失1，2，3，4，5，6 。例如，当缺血性中风未经治疗时，估计轴突以每分钟轴突7英里的速度丢失5 。在TBI的情况下，每年约有170万人在美国经历，轴突变性可能在创伤后几年可能继续发生，因为初始损伤导致长期的神经变性状态4 。加剧这些有害影响，中枢神经系统受到严重限制城市再生1，7，8，9。受伤后，出现抑制环境，其特征在于缺乏远距离靶点的指导性指导，阻止神经突生长的髓磷脂相关抑制剂的存在，以及由反应性星形胶质细胞形成胶质瘢痕8,10,11,12。胶质瘢痕可作为再生的生化和物理障碍，硫酸软骨素蛋白多糖等分子阻碍轴突长出8,11。此外，即使在成人CNS中发现了神经干细胞，新神经元的产生也是有限的，因为在嗅球中仅发现了神经发生的一致证据，海马脊髓区域，脑室周围区域和脊髓中央管道13,14 。这些障碍阻碍了损伤或疾病后遗失的神经元和白质结构的功能恢复，导致这些病症经常改变生命和延长的效果。 尽管成人中枢神经系统缺乏再生能力，但是已经证明，如果向宿主神经元15,16,17,18提供足够的环境线索，则轴突再生是可能的。研究人员尝试提供和操纵生长因子（ 如神经生长因子，表皮生长因子，神经胶质依赖性生长因子和神经营养因子-3）和其他指导分子，以刺激可塑性和轴突再生14 ，/ sup&gt; 18，19 。即使这些研究已经证实成年轴突能够响应生长因子，这些策略受到血脑屏障的低渗透性和促进再生所需的特定空间和时间梯度的限制14,18,19。其他方法依赖于CNS神经元中再生相关转录因子的过度活化。例如，Stat3转录因子的过度表达刺激视神经中的轴突再生20 。然而，生物分子递送和转录因子的过表达都不能代替丢失的神经元群体。基于细胞的策略主要集中在将神经干细胞（NSCs）移植到CNS中，利用其替代CNS神经元的能力，释放营养因子，并支持在损伤后发生的神经发生的尝试17 。尽管如此，仍然存在阻碍这种方法的紧迫挑战，包括移植的神经细胞存活，与主机整合的阻碍能力，并且在空间上保持受限制的区域6,14,17,21。此外，单独的细胞传递不能恢复受损或丢失的轴突途径的细胞结构。解决细胞和药物/化学品输送策略面临的问题的另一种方法是将这些方法与生物材料14,22,23的使用相结合。生物材料如水凝胶能够模拟细胞外基质（ECM）的生物化学和物理性质，有助于细胞递送d保留在受伤区域内，并传递生长因子和其他生物活性分子与受控释放22 。这些基于生物材料的策略的有吸引力的特征已经导致在支架移植到损伤区域24,25,26,27,28,29,30之后体内轴突再生的证据。然而，无细胞生物材料策略不能代替丢失的神经元群体;当用作神经元，胶质细胞或神经元前体细胞的递送载体时，生物材料不能重建长距离轴突网络。开发解决轴突途径退化和与CNS损伤和疾病相关的神经元损失的方法的挑战仍然是&lt;sup class ="xref"&gt; 31。 我们的研究小组以前报告了可植入的微组织工程神经网络（micro-TENNs）的发展，这是一种由活性支架组成的神经细胞体，其限于琼脂糖水凝胶-EGC微柱的一端或两端，其中对齐的轴突束延伸穿过该三维（3D）包装1,10,31,32的整个内部。这种技术和以前的方法之间的主要区别之一是微TENN 的细胞结构在体外完全产生，并在之后33,34,35,36,37,38 ，sup class ="xref"&gt; 39，40，41。 体外制备提供了广泛的空间和时间控制细胞表型和取向，机械/物理性质，生物化学提示和外源性因素，这有利于这些支架与植入后的主体整合41,42 。 Micro-TENN是解剖学上的启发，因为它们模拟脑神经解剖学，显示类似于桥接不同功能区域的轴突区域（ 图1A ） 1 。因此，这种策略可能能够在植入损伤区域后物理上替代丢失的白质束和神经元。这种技术也受到发育机制的启发，其中由径向胶质细胞和开创性轴突形成的"天然生物支架"作为细胞的寻路指南分别从室下区和轴突向外移动43 。这些机制在微TENN的对齐轴突区域中重现，这可以通过轴突介导的轴突生长呈现神经细胞迁移和轴突再生的生物通路（ 图1C ） 43 。此外，该策略利用微TENN神经元和原生电路之间的突触整合，形成可能有助于功能恢复的新继电器（ 图1B ）。突触形成的能力也可以允许这种方法根据网络反馈调节CNS并响应宿主组织的能力。例如，可以通过突触相互作用刺激生物支架中的光遗传活性神经元来调节宿主神经元（ 图1D ）。 此外，基于生物材料的管状结构微TENN的作用为细胞粘附，生长，神经突延伸和信号传导提供了足够的环境，而构建体的微型尺寸可能允许微创植入，并提供部分隔离的微环境，用于逐渐融入脑中。事实上，最近的出版物已经证明了微型TENN在植入大鼠脑后模拟神经通路的潜力。在立体定位显微注射之后，我们以前报道了微TENN神经元存活的证据，轴突结构的维持和轴突延伸到主体皮质至少1个月的体内 10,31。此外，用突触蛋白标记提供了与天然组织突触整合的组织学证据10,31。总的来说，微型TENN可能独特地适用于重建和调制损坏CNS通过替换丢失的神经元，与主机电路进行突触整合，恢复损失的轴突细胞结构，并且在某些情况下，为再生轴突提供适当的寻路提示。 <img alt="图1" src="/files/ftp_upload/55609/55609fig1.jpg" /> 图1:微组织工程神经网络（微型TENN）发展背后的原理和启示。 （ A ）Micro-TENN模拟大脑连接体（紫色）的细胞结构，其中功能上不同的区域以单向（红色，绿色）或双向（蓝色）方式通过长对准的轴突束连接。作为一个例子，微型TENN可以重建皮质丘脑和黑质纹状体途径或从内嗅皮质到海马的穿孔途径中的丢失的连接（改编自Struzyna 等 ，2015） 1 。 （ B ）单向图l和双向微型TENN（分别为红色和蓝色）与主机电路（紫色）进行突触式积分，以用作病变两端之间的功能继电器。 （ C ）单向微-TENN（绿色）的轴突区的示意图，作为用于轴突促进再生主轴突（紫色）朝向与微TENN相互作用的靶标的指导。 （ D ）使用光生物活性微TENNS作为神经调节剂的概念图，利用与兴奋性或抑制性神经元的突触整合（底部）。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55609/55609fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a> 目前的手稿详细介绍了使用胚胎衍生的大脑皮质神经元制造微型TENN的方法。值得注意的是，微TENN可以用其他类型的神经细胞制造。例如充足的，成功的微型TENN发展的初步报告是背根神经节（DRG）神经元32 。可以通过将液体琼脂糖加入到定制的激光切割的圆柱形通道阵列或毛细管中（均包含对准的针灸针）来产生水凝胶微柱（ 图2A ）。针形成内腔并确定微柱的内径（ID），而激光切割装置中的毛细管ID和圆柱体的直径决定了构造体的外径（OD）。 OD和ID可以根据所需的应用选择，分别选择器件/毛细管和针灸针的不同直径。微柱的长度也可以变化;到目前为止，我们已经报道了长达10毫米的微型TENN的建设10 ，并且正在积极追求更长的长度。琼脂糖凝胶和针灸后eedles被去除，通常由I型胶原和层粘连蛋白组成的ECM溶液被添加到构建体的内腔（ 图2C ）。 ECM核心提供支架，以支持神经细胞粘附和轴突生长。最初，使用解离的细胞悬浮液10,31,32，将原代大鼠皮质神经元电镀在微量柱中。然而，这种方法在所有情况下都没有产生靶细胞结构，其被定义为限于微柱末端的神经细胞体，其中心腔由纯对准的轴突区组成。从那时起，使用强制神经元聚集方法（基于Ungrin 等人改编的协议）使得具有理想结构的微TENN更加可靠和一致的制造（ 图2B ） 44 。除了描述当前方法论，本文将展示微型TENNs的代表性相位对比和共聚焦图像，证明随着时间的推移形成轴突束，以及完成的目标细胞结构。该手稿还将扩大协议的重要方面，还将展示微型TENN技术的未来挑战和未来发展方向。 <img alt="图2" src="/files/ftp_upload/55609/55609fig2.jpg" /> 图2:三阶段微型TENN制造工艺的示意图。 （ A ）琼脂糖水凝胶的开发:（i）最初，将小针灸针（ 例如 ，直径为180-350μm）插入定制的激光切割模具或毛细管的圆柱形通道中（ 例如 ，直径380-700μm）。在下一步中，将DPBS中的液体琼脂糖引入圆柱形通道或毛细管中。 （ii）琼脂糖凝胶后，取出针头将模具拆开以产生中空的琼脂糖微柱。 （iii）然后将这些构建体灭菌并储存在DPBS中。 （ B ）主要神经元培养和聚集方法:（i）神经元聚集在适合于12孔培养板的孔中的3D印刷模具铸造的金字塔微孔阵列中进行。 （ii）微TENN包括从胚胎-18天大鼠的胎脑分离的原代大鼠神经元。在用胰蛋白酶-EDTA和DNA酶I组织解离之后，制备密度为1.0-2.0×10 6个细胞/ mL的细胞溶液。 （iii）将12μL该溶液转移到锥体微孔阵列中的每个孔中。将含有这些微孔的板离心以产生细胞聚集体。 （iv）然后将它们在电镀之前在微柱中孵育过夜。 （ C ）ECM核心制备和细胞接种:（i）细胞播种前，将含有1mg / mL I型胶原和1mg / mL的ECM溶液层粘连蛋白转移到微TENN的内部并使其聚合。 （ii）根据单向或双向微型TENN是否正在制造，聚集体分别放置在微柱的一个或两个极端。 （iii）经过一段时间的温育以促进粘附，将微型TENN在充满补充的胚胎神经元基础培养基的培养皿中培养。 （iv）在培养3-5天后，最终的微TENN结构应在微柱的极端处展示细胞聚集体，其轴突束跨越其长度。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55609/55609fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>Laser cutter</td><td>Universal Laser Systems</td><td>PLS4.75</td><td>Used to fabricate the laser-cut micro-channel mold.</td></tr><tr><td>Laser-cut micro-column fabrication device</td><td>Custom-made</td><td>--------------</td><td>Contact our research group if interested. Dimensions and blueprints provided in the manuscript.</td></tr><tr><td>Screws</td><td>--------------</td><td>--------------</td><td>#4-40 with a thread diameter of 3.05 mm</td></tr><tr><td>Nuts</td><td>--------------</td><td>--------------</td><td>#4-40 with a thread diameter of 3.05 mm</td></tr><tr><td>Acupuncture needle (180 &amp;micro;m diameter)</td><td>Lhasa Medical</td><td>sj.16X40</td><td>The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column lumen.</td></tr><tr><td>Petri dish</td><td>Fisher</td><td>08772B</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s phosphate buffered saline (DPBS)</td><td>Invitrogen</td><td>14200075</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene disposable serological pipet</td><td>Fisher</td><td>13-678-11D</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9539-50G</td><td></td></tr><tr><td>Capillary tube (398 &amp;micro;m diameter)</td><td>Fisher</td><td>21170D</td><td>The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column shell.</td></tr><tr><td>Hot plate</td><td>Fisher</td><td>SP88857200</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic bar</td><td>Fisher</td><td>1451352</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette</td><td>Sigma</td><td>Z683884-1EA</td><td></td></tr><tr><td>25 mm gauge needle</td><td>Fisher</td><td>14-826-49</td><td></td></tr><tr><td>Microscalpel</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-6270</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14081-09</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>501985</td><td></td></tr><tr><td>Hot bead sterilizer</td><td>Sigma</td><td>Z378550-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Stereoscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ800N</td><td>Used for all dissection steps and for micro-TENN fabrication.</td></tr><tr><td>Rat tail type I collagen</td><td>Corning</td><td>354236</td><td>Maintain at 4 &amp;ordm;C and remove only when needed.&amp;nbsp; Use ice to preserve its temperature when in use.</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tube</td><td>Fisher</td><td>02-681-256</td><td></td></tr><tr><td>Mouse laminin</td><td>Corning</td><td>354232</td><td>Maintain at 4 &amp;ordm;C and remove only when needed.&amp;nbsp; Use ice to preserve its temperature when in use.</td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Invitrogen</td><td>21103049</td><td>Basal medium for the culture of pre-natal and embryonic neuronal cells. Store at 4&amp;ordm;C and warm at 37 &amp;ordm;C before use.</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide (NaOH)</td><td>Fisher</td><td>SS2661</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid (HCl)</td><td>Fisher</td><td>SA48-1</td><td></td></tr><tr><td>Litmus paper</td><td>Fisher</td><td>09-876-18</td><td></td></tr><tr><td>Hank&#039;s balanced salt solution (HBSS)</td><td>Invitrogen</td><td>14170112</td><td>Store at 4 &amp;ordm;C.</td></tr><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200056</td><td>Store at -20 &amp;ordm;C and warm at 37 &amp;ordm;C before use.</td></tr><tr><td>Bovine pancreatic deoxyribonuclease (DNase) I</td><td>Sigma</td><td>10104159001</td><td>Store at -20 &amp;ordm;C and warm at 37 &amp;ordm;C before use.</td></tr><tr><td>B-27 Supplement</td><td>Invitrogen</td><td>12587010</td><td>Supplement added to Neurobasal medium for the culture of hippocampal and cortical neurons. Store at -20 &amp;ordm;C and warm at 37 &amp;ordm;C before use.</td></tr><tr><td>L-glutamine&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>35050061</td><td>Store at -20 &amp;ordm;C and warm at 37 &amp;ordm;C before use.</td></tr><tr><td>Sprague Dawley embryonic day 18 rats</td><td>Charles River</td><td>Strain 001</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipette</td><td>Fisher</td><td>22-042816</td><td></td></tr><tr><td>15 mL centrifuge tube</td><td>EMESCO</td><td>1194-352099</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Fisher</td><td>02-215-414</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Fisher</td><td>05-413-115</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Fisher</td><td>02-671-6</td><td></td></tr><tr><td>Objet30 3D-Printer</td><td>Stratasys&amp;nbsp;</td><td>--------------</td><td>Used to fabricate the pyramidal micro-well molds.</td></tr><tr><td>3D-printed pyramidal well mold</td><td>Custom-made</td><td>--------------</td><td>Contact our research group if interested. Dimensions and blueprints provided in the manuscript.</td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxane (PDMS) and curing agent</td><td>Fisher</td><td>NC9285739</td><td>Comes as kit with elastomer and curing agent. Use inside a chemical fume hood.</td></tr><tr><td>Funnel</td><td>Fisher</td><td>10-348C</td><td></td></tr><tr><td>1 ml pipette bulb</td><td>Sigma</td><td>Z509035</td><td></td></tr><tr><td>Micro-spatula</td><td>Fisher</td><td>S50821</td><td></td></tr><tr><td>12-well culture plate</td><td>EMESCO</td><td>1194-353043</td><td></td></tr><tr><td>Oven</td><td>Fisher</td><td>11-475-154</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Fisher</td><td>13 998 076</td><td></td></tr><tr><td>AAV1.Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40</td><td>UPenn Vector Core</td><td>36373</td><td>Store at -80&amp;ordm;C. Commercially available adeno-associated virus (AAV) with the GCaMP6f calcium indicator.</td></tr><tr><td>Formaldehyde 40%</td><td>Fisher</td><td>F77P-4</td><td>Formaldehyde is a toxic compound known to be carcinogenic, and must be disposed of in a separate container.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>Non-ionic surfactant used to permeabilize cell membranes.</td></tr><tr><td>Horse serum</td><td>Gibco</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-Tuj-1/beta-III tubulin primary antibody</td><td>Sigma</td><td>T8578-200UL</td><td>Store at -20&amp;ordm;C.</td></tr><tr><td>Rabbit anti-synapsin 1 primary antibody</td><td>Synaptic Systems</td><td>106-001</td><td>Store at -20&amp;ordm;C.</td></tr><tr><td>Donkey anti-mouse 568 secondary antibody</td><td>Invitrogen</td><td>A10037</td><td>Store at 4&amp;ordm;C.</td></tr><tr><td>Donkey anti-rabbit 488 secondary antibody</td><td>Invitrogen</td><td>A21206</td><td>Store at 4&amp;ordm;C.</td></tr><tr><td>Hoechst 33342, Trihydrochloride</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>Store at 4&amp;ordm;C.&amp;nbsp; Hoechst is a known mutagen that should be treated as a carcinogen.&amp;nbsp; Therefore, it must be disposed of in a separate container.</td></tr><tr><td>A1RSI Laser Scanning Confocal Microscope&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td>--------------</td><td>Used for taking the confocal reconstructions of immunolabeled constructs.</td></tr><tr><td>Eclipse Ti-S Microscope&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td>--------------</td><td>Used for taking the phase-contrast images.&amp;nbsp; With digital image acquisition using a QiClick camera interfaced with Nikon Elements Basic Research software (4.10.01).</td></tr><tr><td>High-speed Fluorescence Microscope</td><td>Nikon</td><td>--------------</td><td>Nikon Eclipse Ti microscope paired with an ANDOR Neo/Zyla camera for calcium imaging.</td></tr><tr><td>NIS Elements AR 4.50.00 Software</td><td>Nikon Instruments</td><td>--------------</td><td>Used to identify calcium transients from the recordings taken with the high-speed fluorescence microscope.&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

anatomically inspired three-dimensional micro-tissue engineered neural networks for nervous system reconstruction, modulation, and modeling

由于抑制环境和神经发生能力有限，功能恢复很少发生在中枢神经系统（CNS）中的损伤或疾病诱导的变性之后。我们正在开发一种同时解决损伤的CNS内的神经元和轴突途径损失的策略。该手稿提出了微组织工程神经网络（微型TENN）的制造方案，由神经元组成的可植入构造物和跨越细胞外基质（ECM）腔的对准轴突束，其预先形成的直径为数百微米的水凝胶圆柱体可以延伸厘米长度。神经元聚集体被划分为三维包围的极端，并被轴突突起所跨越。微型TENN作为CNS重建的策略是独一无二的，模拟了脑连接体细胞结构的方面，并为潜在的网络替代提供了手段。神奈轮状聚集体可能与宿主组织突触形成新的功能性继电器，以恢复和/或调节丢失或损坏的电路。这些构建体也可以作为能够利用细胞迁移和轴索寻路的发育机制的再生"活支架"，基于再生状态提供协同的结构和可溶性线索。将微型TENN通过将液体水凝胶倒入含有纵向中心针的圆柱形模具中来制造。一旦水凝胶凝胶化，就去除针头，留下中空微柱。将ECM溶液加入腔内以提供适合于神经元粘附和轴突生长的环境。机械地聚集离解的神经元用于在微柱的一端或两端精确播种。该方法可靠地产生具有长突出的轴突束的自足的微型构造，其可以重现脑神经解剖学的特征。突触动物非标记和遗传编码的钙指标表明微TENN具有广泛的突触分布和内在的电活动。因此，微型TENN代表脑途径靶向神经外科重建的有希望的策略，也可作为生物学模型应用于体外研究神经生物学现象 。

使用相差显微镜监测微TENNs，以评估其细胞结构和轴突生长（ 图4 ）。在单向，2mm长的微TENNs中，神经元聚集体被限制在微柱的一端并且通过内核投射一束轴突。轴突将体外的整个长度跨越5天（DIV）（ 图4A ）。双向2 mm长的微型TENN中的初始轴突生长率较高，因为轴突通过3 DIV跨越整个微柱（ 图4B ）。通过5 DIV，双向微TENNs特征是密集的轴突区域，连接保持在微柱极端的聚集体。在5-mm微TENNs中也观察到这种细胞结构，轴突通过5 DIV跨越微柱（ 图4C ）。如在所有情况下观察到的，腔内的ECM和几何恢复琼脂糖提供的表达提供了形成轴突区域所需的方向性，其结构模拟天然神经解剖学的特征。 在该方案中应用免疫细胞化学技术，并采用共焦图像来验证微TENN结构的组分。用Hoechst（蓝色）染色的细胞核几乎完全定位在单向和双向微柱的极端聚集体内，内部基本上没有Hoechst染色（ 图5 ）。这一观察证实了从相位对比图像中推断的结果:神经元群体仅限于末端，只有轴突（红色）跨越微TENN的内腔。然而，在轴突穿过聚集体之后，观察到沿着轴突区域进入内腔的细胞迁移，如28DIV内部存在细胞核（蓝色）所观察到的，长2mm微小TENN（ 图6 ）。此外，在整个细胞体和轴突区域发现突触蛋白I免疫标记（绿色）（ 图6 ）。突触蛋白I是涉及神经递质释放调节的突触前终蛋白，并且指示当在点状分布中发现时突触前终点的存在;之前已经通过全细胞贴片记录49形成活动性突触相关。在微TENN的富含轴突的中心区域中的突触蛋白染色可能是点状突起以及从轴突向突触前端转运的突触素的组合。然而，微TENN聚集体内突触素斑点的存在表明，这些构建体具有通过突触通信的能力，尽管突触蛋白与突触后蛋白质的共定位将需要进一步的功能性突触的结构性证据。/ P&gt; 还用含有GCaMP6f钙指示剂的AAV转导的聚集神经元来制备微TENN，以初步探测这些构建体的电生理学性质。这些构建体在整个长度上表达钙指示剂，如神经元聚集体和轴突区域中的荧光所示 （ 图7A ）。请注意，由于旨在最大化聚集体强度的显微镜设置，轴突区域中的荧光显得更加明显。用高速荧光显微镜（无外部电刺激）随时间分析这些转导的微TENN，并在代表性的微TENN中随机选择几个细胞大小的感兴趣区域（ROI），以表征这些细胞的信号传导能力结构体。几乎所有的投资回报率都观察到钙浓度突发，这反映在相关领域随时间变化的荧光强度（ 图7B ）。特别地，各种ROI似乎显示钙浓度增加的近恒定周期（ 图7B ）。这些钙浓度变化被推断为自发的，固有的动作电位，个体聚集体内的细胞信号传导和/或来自不同聚集体的轴突信号的结果。需要进一步的分析来完全表征微TENN内神经元和轴突区的电生理特性。然而，这些初步结果表明微TENNs表现出强大的内源/基线电活动。 <img alt="图3" src="/files/ftp_upload/55609/55609fig3.jpg" /> 图3:激光切割微柱制造装置的蓝图和用于细胞聚集的3D印刷金字塔微孔模具。 （ A） - （ B ）分别用于制造水凝胶微柱的圆柱形通道阵列的底部和上半部的蓝图和图像。 （ C ）用于将设备保持在一起的蓝图和图像。前部和后部片段均具有相同的尺寸。 （ D ）制造微柱所需的组装装置的图像。只有两个盖子和下半部分用下面的两个定位孔（左）中的螺钉夹紧在一起。虚线显示针刺针穿过每个帽子上的五个孔的位置。将液体琼脂糖添加到圆筒的下半部分，然后将上半部分（右）放置在装置上以将液体琼脂糖模塑成形。 （ E ）用于制造PDMS微孔阵列的3D印刷模具的蓝图。 （ F ）3D打印模具（左）和PDMS微孔阵列（右）的图像。所有尺寸均为毫米<html>米（mm）。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55609/55609fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a> <img alt="图4" src="/files/ftp_upload/55609/55609fig4.jpg" /> 图4:通过单向和双向构建体的相差成像作为体外天数的函数观察微TENNS中的轴突生长。 （ A ）单向2 mm长的微型TENNs显示了通过5 DIV将微柱的几乎整个长度延伸的轴突束。 （ B ）与单向微TENN相比，双向2mm微TENNs显示更快的轴突生长速率。 （ C ）对于5 mm双向微TENN，轴突区域以5 DIV填充微柱的长度。这种架构至少保持到10 DIV。刻度棒=200μm。/ftp_upload/55609/55609fig4large.jpg"target ="_ blank"&gt;请点击此处查看此图的较大版本。 <img alt="图5" src="/files/ftp_upload/55609/55609fig5.jpg" /> 图5:用免疫标记的单向和双向微TENN的共聚焦图像观察到的微-TENN细胞结构。细胞染色细胞核（Hoechst;蓝色）和轴突（Tuj1;红色）。 （ A ）5mm双向微型TENN（28DIV）的相位对比图像。分别为5mm双向（28DIV）和单向（25DIV）微型TENN的共焦重建（ D ） - （ F ）和（ I ） - （ K ）显示标记的细胞核（ D ），（ I ）和轴突（ E ），（ J ），以及覆盖（ F ），（ K ）。刻度棒:500μm。 （ A </st（ F ）和（ K ）指神经元聚集体和轴突束的相位对比度（ B ） - （ C ）和共聚焦（ G ） - （ H ），（ L ） - （ M ） 。图像显示限制在微TENN的末端的聚集体，而管腔由对准的轴突束跨越。刻度棒=100μm。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55609/55609fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a> <img alt="图6" src="/files/ftp_upload/55609/55609fig6.jpg" /> 图6:突触前蛋白突触蛋白I在代表性的双向微TENN中的表达。构建体对细胞核（Hoechst;蓝色），轴突（Tuj1;红色）和突触前突触（突触蛋白I;绿色）进行染色。 （ A ）Phase-contr在28 DIV的2 mm双向微型TENN的ast图像。 （ D ） - （ G ）显示三个通道的细胞核（ D ），轴突（ E ），突触前突触（ F ）和覆盖物（ G ））的共焦重建。盒子分别显示神经元聚集体的相位对比度和重叠图像的放大（ B ） - （ C ），（ H ） - （ I ）。刻度棒=100μm。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55609/55609fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a> <img alt="图7" src="/files/ftp_upload/55609/55609fig7.jpg" /> 图7:通过表达遗传编码的钙指示剂观察到的双向微TENN中的自发信号传导活性。 （ A ）荧光灯e显微镜证实了GCaMP报告基因的表达，如通过聚集体和轴突中的荧光观察到的。刻度棒=100μm。 （ B ）在几个感兴趣的区域（ROI）作为时间的函数测量与钙浓度变化相关的荧光变化。 （ A ）中编号的彩色圆圈表示这些ROI。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55609/55609fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a> <img alt="图8" src="/files/ftp_upload/55609/55609fig8.jpg" /> 图8:微型TENN方法的常见故障模式的相位对比图像。 （ A ）在制造的初始阶段DPBS的去除和/或蒸发的结果是完全脱水/干燥的琼脂糖微柱。比例尺= 5081;米。 （ B ）由于缺乏针刺针与毛细血管的同心对准，水凝胶微柱的管腔内衬建筑物的外壁。刻度棒=100μm。 （ C ）具有两个聚集体的接种微量TENN存在于1DIV。 （ D ）其中一个聚集体与3 DIV的（ C ）相同的微柱脱落。 （ E ）4 DIV处的单向微型TENN。 （ F ）（ E ）中的聚集体和轴突束从微柱中脱落，并保持在5DIV的培养基中漂浮。 （ C ） - （ E ）= 300μm的比例尺。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55609/55609fig8large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>

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Anatomically Inspired Three-dimensional Micro-tissue Engineered Neural Networks for Nervous System Reconstruction, Modulation, and Modeling

该手稿详细描述了微组织工程神经网络的制造:三维微米大小的构建体，包括跨越聚集的神经元群体的长比例的轴突区域，其包裹在管状水凝胶中。这些生活支架可以作为功能性继电器来重建或调节神经回路，或者作为模拟灰白色神经解剖学的生物学检验床。

解剖学启发的三维微组织工程神经网络用于神经系统重建，调制和建模

Functional recovery rarely occurs&#160;following injury or disease-induced degeneration within the central nervous system (CNS)&#160;due to the inhibitory ...

anatomically-inspired-three-dimensional-micro-tissue-engineered

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.7K 次观看.  University of Pennsylvania. 该手稿详细描述了微组织工程神经网络的制造:三维微米大小的构建体，包括跨越聚集的神经元群体的长比例的轴突区域，其包裹在管状水凝胶中。这些生活支架可以作为功能性继电器来重建或调节神经回路，或者作为模拟灰白色神经解剖学的生物学检验床。 

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Engineered 3D Silk-collagen-based Model of Polarized Neural Tissue

Despite huge efforts to decipher the anatomy, composition and function of the brain, it remains the least understood organ of the human body. To gain a deeper comprehension of the neural system scientists aim to simplistically reconstruct the tissue by assembling it in vitro from basic building blocks using a tissue engineering approach. Our group developed a tissue-engineered silk and collagen-based 3D brain-like model resembling the white and gray matter of the cortex. The model consists of silk porous sponge, which is pre-seeded with rat brain-derived neurons, immersed in soft collagen matrix. Polarized neuronal outgrowth and network formation is observed with separate axonal and cell body localization. This compartmental architecture allows for the unique development of niches mimicking native neural tissue, thus enabling research on neuronal network assembly, axonal guidance, cell-cell and cell-matrix interactions and electrical functions.

Insight into the complex actions of the brain requires advanced research tools. Here we demonstrate a novel silk-collagen-based 3D engineered model of neural tissue resembling brain-like architecture. The model can be used to study neuronal network assembly, axonal guidance, cell-cell interactions and electrical activity.

极化神经组织工程三维蚕丝胶原蛋白为基础的模式

Despite huge efforts to decipher the anatomy, composition and function of the brain, it remains the least understood organ of the human body. To gain a ...

科研

生物工程

Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying the human brain. One emerging technology to address this issue is the use of three dimensional (3D) neural cell cultures, termed &#39;organoids&#39; or &#39;spheroids&#39;, for long term preservation of intercellular interactions including extracellular adhesion molecules. However, these culture systems are time consuming and not systematically generated. Here, we detail a method to rapidly and consistently produce 3D cocultures of neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells. First, pre-differentiated astrocytes and neuronal progenitors are dissociated and counted. Next, cells are combined in sphere-forming dishes with a Rho-Kinase inhibitor and at specific ratios to produce spheres of reproducible size. After several weeks of culture as floating spheres, cocultures (&#39;asteroids&#39;) are finally sectioned for immunostaining or plated upon multielectrode arrays to measure synaptic density and strength. In general, it is expected that this protocol will yield 3D neural spheres that display mature cell-type restricted markers, form functional synapses, and exhibit spontaneous synaptic network burst activity. Together, this system permits drug screening and investigations into mechanisms of disease in a more suitable model compared to monolayer cultures.

In this protocol, we aim to describe a reproducible method for combining dissociated human pluripotent stem cell derived neurons and astrocytes together into 3D sphere cocultures, maintaining these spheres in free floating conditions, and subsequently measuring synaptic circuit activity of the spheres with immunoanalysis and multielectrode array recordings.

3D Cocultures 星形胶质细胞与人多潜能干细胞神经元的突触电路建模

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying ...

发育生物学

Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays to characterize the differentiated cells. The E14 mouse embryonic stem cells were used to form embryoid bodies through the hanging drop method, and then induced to differentiate into neural progenitor cells by retinoic acid, and finally differentiated into neurons. Quantitative&#160;reverse transcription&#160;polymerase chain reaction (RT-qPCR) and immunofluorescence experiments revealed that the neural progenitors and neurons exhibit corresponding markers (nestin for neural progenitors and neurofilament for neurons) at day 8 and 12 post-differentiation, respectively. Flow cytometry experiments on an E14 line expressing a Sox1 promoter-driven GFP reporter showed that about 60% of cells at day 8 are GFP positive, indicating the successful differentiation of neural progenitor cells at this stage. Finally, RNA-seq analysis was used to profile the global transcriptomic changes. These methods are useful for analyzing the involvement of specific genes and pathways in regulating the cell identity transition during neuronal differentiation.

We describe the procedure for the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells into neuronal cells using the hanging drop method. Furthermore, we perform a comprehensive phenotypic analysis through RT-qPCR, immunofluorescence, RNA-seq, and flow cytometry.

小鼠胚胎干细胞中神经祖细胞和神经元的分化与表征

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays ...

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to replace lost neurons and regenerate axonal pathways. However, during nervous system development, neuronal migration and axonal extension often occur along pathways formed by other cells, referred to as &#34;living scaffolds&#34;. Seeking to emulate these mechanisms and to design a strategy that circumvents the inhibitory environment of the CNS, this manuscript presents a protocol to fabricate tissue engineered astrocyte-based &#34;living scaffolds&#34;. To create these constructs, we employed a novel biomaterial encasement scheme to induce astrocytes to self-assemble into dense three-dimensional bundles of bipolar longitudinally-aligned somata and processes. First, hollow hydrogel micro-columns were assembled, and the inner lumen was coated with collagen extracellular-matrix. Dissociated cerebral cortical astrocytes were then delivered into the lumen of the cylindrical micro-column and, at a critical inner diameter of &#60;350 &#181;m, spontaneously self-aligned and contracted to produce long fiber-like cables consisting of dense bundles of astrocyte processes and collagen fibrils measuring &#60;150 &#181;m in diameter yet extending several cm in length. These engineered living scaffolds exhibited &#62;97% cell viability and were virtually exclusively comprised of astrocytes expressing a combination of the intermediate filament proteins glial-fibrillary acidic protein (GFAP), vimentin, and nestin. These aligned astrocyte networks were found to provide a permissive substrate for neuronal attachment and aligned neurite extension. Moreover, these constructs maintain integrity and alignment when extracted from the hydrogel encasement, making them suitable for CNS implantation. These preformed constructs structurally emulate key cytoarchitectural elements of naturally occurring glial-based &#34;living scaffolds&#34; in vivo. As such, these engineered living scaffolds may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms in vitro or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding following CNS degeneration in vivo.

We showcase the development of self-assembled, three-dimensional bundles of longitudinally aligned astrocytic somata and processes within a novel biomaterial encasement. These engineered &#34;living scaffolds&#34;, exhibiting micron-scale diameter yet extending centimeters in length, may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding.

三维组织工程化排列的星形胶质细胞网络, 以概括发展机制和促进神经系统再生

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the gold-standard experimental model to study basic neurophysiological mechanisms involved in the formation and maintenance of neuronal cell assemblies. However, in vitro studies have been limited to the recording of the electrophysiological activity generated by bi-dimensional (2D) neural networks. Nonetheless, given the intricate relationship between structure and dynamics, a significant improvement is necessary to investigate the formation and the developing dynamics of three-dimensional (3D) networks. In this work, a novel experimental platform in which 3D hippocampal or cortical networks are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are realized by seeding neurons in a scaffold constituted of glass microbeads (30-40 &#181;m in diameter) on which neurons are able to grow and form complex interconnected 3D assemblies. In this way, it is possible to design engineered 3D networks made up of 5-8 layers with an expected final cell density. The increasing complexity in the morphological organization of the 3D assembly induces an enhancement of the electrophysiological patterns displayed by this type of networks. Compared with the standard 2D networks, where highly stereotyped bursting activity emerges, the 3D structure alters the bursting activity in terms of duration and frequency, as well as it allows observation of more random spiking activity. In this sense, the developed 3D model more closely resembles in vivo neural networks.

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

In this work, a novel experimental model in which 3D neuronal cultures are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are built by seeding neurons in a scaffold made up of glass microbeads on which neurons grow and form interconnected 3D structures.

接口3D工程神经细胞微电极阵列:一种创新<em&gt;体外</em&gt;实验模型

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the ...

神经科学

Generation of 3D Midbrain Organoids from Human-Induced Pluripotent Stem Cells

The development of midbrain organoids (MOs) from human pluripotent stem cells (hPSCs) represents a significant advancement in understanding brain development, facilitating precise disease modeling, and advancing therapeutic research. This protocol outlines a method for generating midbrain-specific organoids using induced pluripotent stem cells (iPSCs), employing a strategic differentiation approach. Key techniques include dual-SMAD inhibition to suppress SMAD signaling, administration of fibroblast growth factor 8b (FGF-8b), and activation of the Sonic Hedgehog pathway using the agonist purmorphamine, guiding iPSCs towards a midbrain fate.
The organoids produced by this method achieve diameters up to 2 mm and incorporate a diverse array of neuroepithelial cell types, reflecting the midbrain&#39;s inherent cellular diversity. Validation of these organoids as authentic midbrain structures involves the expression of midbrain-specific markers, confirming their identity. A notable outcome of this methodology is the effective differentiation of iPSCs into dopaminergic neurons, which are characteristic of the midbrain.
The significance of this protocol lies in its ability to produce functionally mature, midbrain-specific organoids that closely replicate essential aspects of the midbrain, offering a valuable model for in-depth exploration of midbrain developmental processes and the pathophysiology of related disorders such as Parkinson&#39;s disease. Thus, this protocol serves as a crucial resource for researchers seeking to enhance our understanding of the human brain and develop new treatments for neurodegenerative diseases, making it an indispensable tool in the field of neurological research.

This protocol describes a novel method for creating 3D midbrain organoids from human induced pluripotent stem cells, guiding their formation to mimic native midbrain tissue, thereby aiding in the study of development and disorders.

从人诱导多能干细胞生成 3D 中脑类器官

The development of midbrain organoids (MOs) from human pluripotent stem cells (hPSCs) represents a significant advancement in understanding brain ...

Preparation and Characterization of Graphene-Based 3D Biohybrid Hydrogel Bioink for Peripheral Neuroengineering

Peripheral neuropathies can occur as a result of axonal damage, and occasionally due to demyelinating diseases. Peripheral nerve damage is a global problem that occurs in 1.5%-5% of emergency patients and may lead to significant job losses. Today, tissue engineering-based approaches, consisting of scaffolds, appropriate cell lines, and biosignals, have become more applicable with the development of three-dimensional (3D) bioprinting technologies. The combination of various hydrogel biomaterials with stem cells, exosomes, or bio-signaling molecules is frequently studied to overcome the existing problems in peripheral nerve regeneration. Accordingly, the production of injectable systems, such as hydrogels, or implantable conduit structures formed by various bioprinting methods has gained importance in peripheral neuro-engineering. Under normal conditions, stem cells are the regenerative cells of the body, and their number and functions do not decrease with time to protect their populations; these are not specialized cells but can differentiate upon appropriate stimulation in response to injury. The stem cell system is under the influence of its microenvironment, called the stem cell niche. In peripheral nerve injuries, especially in neurotmesis, this microenvironment cannot be fully rescued even after surgically binding severed nerve endings together. The composite biomaterials and combined cellular therapies approach increases the functionality and applicability of materials in terms of various properties such as biodegradability, biocompatibility, and processability. Accordingly, this study aims to demonstrate the preparation and use of graphene-based biohybrid hydrogel patterning and to examine the differentiation efficiency of stem cells into nerve cells, which can be an effective solution in nerve regeneration.

In this manuscript, we demonstrate the preparation of a biohybrid hydrogel bioink containing graphene for use in peripheral tissue engineering. Using this 3D biohybrid material, the neural differentiation protocol of stem cells is performed. This can be an important step in bringing similar biomaterials to the clinic.

用于外周神经工程的石墨烯基3D生物杂化水凝胶生物墨水的制备与表征

Peripheral neuropathies can occur as a result of axonal damage, and occasionally due to demyelinating diseases. Peripheral nerve damage is a global ...

Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation

A fascicle of axons is one of the major structural motifs observed in the nervous system. Disruption of axon fascicles could cause developmental and neurodegenerative diseases. Although numerous studies of axons have been conducted, our understanding of formation and dysfunction of axon fascicles is still limited due to the lack of robust three-dimensional in vitro models. Here, we describe a step-by-step protocol for the rapid generation of a motor nerve organoid (MNO) from human induced pluripotent stem (iPS) cells in a microfluidic-based tissue culture chip. First, fabrication of chips used for the method is described. From human iPS cells, a motor neuron spheroid (MNS) is formed. Next, the differentiated MNS is transferred into the chip. Thereafter, axons spontaneously grow out of the spheroid and assemble into a fascicle within a microchannel equipped in the chip, which generates an MNO tissue carrying a bundle of axons extended from the spheroid. For the downstream analysis, MNOs can be taken out of the chip to be fixed for morphological analyses or dissected for biochemical analyses, as well as calcium imaging and multi-electrode array recordings. MNOs generated with this protocol can facilitate drug testing and screening and can contribute to understanding of mechanisms underlying development and diseases of axon fascicles.

This protocol provides a comprehensive procedure to fabricate human iPS cell-derived motor nerve organoid through spontaneous assembly of a robust bundle of axons extended from a spheroid in a tissue culture chip.

三维运动神经器官生成

A fascicle of axons is one of the major structural motifs observed in the nervous system. Disruption of axon fascicles could cause developmental and ...

iPSC 来源的神经元和星形胶质细胞的 3D 生物打印共培养物

Three-Dimensional Bioprinting of Human iPSC-Derived Neuron-Astrocyte Cocultures for Screening Applications

For a cell model to be viable for drug screening, the system must meet throughput and homogeneity requirements alongside having an efficient development time. However, many published 3D models&#160;do not satisfy these criteria. This therefore, limits their usefulness in early drug discovery applications. Three-dimensional (3D) bioprinting is a novel technology that can be applied to the development of 3D models to expedite development time, increase standardization, and increase throughput. Here, we present a protocol to develop 3D bioprinted coculture models of human induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived glutamatergic neurons and astrocytes. These cocultures are embedded within a hydrogel matrix of bioactive peptides, full-length extracellular matrix (ECM) proteins, and with a physiological stiffness of 1.1 kPa. The model can be rapidly established in 96-well and 384-well formats and produces an average post-print viability of 72%. The astrocyte-to-neuron ratio in this model is shown to be 1:1.5, which is within the physiological range for the human brain. These 3D bioprinted cell populations also show expression of mature neural cell type markers and growth of neurite and astrocyte projections within 7 days of culture. As a result, this model is suitable for analysis using cell dyes and immunostaining techniques alongside neurite outgrowth assays. The ability to produce these physiologically representative models at scale makes them ideal for use in medium-to-high throughput screening assays for neuroscience targets.

作者聚焦:推进 3D 细胞建模 – 一种用于神经共培养的高通量方法 

Here, we present a protocol to produce 3D-bioprinted cocultures of iPSC-derived neurons and astrocytes. This coculture model, generated within a hydrogel scaffold in 96- or 384-well formats, demonstrates high post-print viability and neurite outgrowth within 7 days and shows the expression of maturity markers for both cell types.

人 iPSC 衍生的神经元-星形胶质细胞共培养物的三维生物打印用于筛选应用

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