免疫组织化学和免疫细胞化学:通过光显微镜进行组织成像

1. 免疫细胞化学细胞的制备

1. 通过在24孔培养板的孔中加入0.5 mL的细胞悬浮液，将感兴趣的种子细胞添加到室片或室盖上。
   注意:有些细胞可能需要在经过处理的盖玻片上生长，例如用多莱塞处理的盖玻片。最佳治疗条件应由用户根据所使用的细胞类型确定。
2. 将板放入加_湿CO2培养箱中，让细胞在37°C生长，直到50-70%汇合。
3. 一旦细胞达到最佳汇合，从每个孔中取出培养培养物，然后，通过在0.5 mL的4%PFA（在1X PBS中稀释）孵育细胞，并在室温下孵育20分钟，从而修复细胞。
4. 用 1 mL 1X PBS 去除固定剂并清洗水井三次。
5. 接下来，通过在1X PBS中加入0.5 mL 0.1%的Triton-X-100到每个井中，并在室温下孵育15分钟，从而渗透细胞。
6. 吸气缓冲液，用 1x PBS 的 1 mL 洗井三次。
7. 盖玻上的细胞现在被固定和渗透。继续为以下免疫组织化学示例演示的染色程序 - 除了孵育应在 24 孔板的孔内进行，而不是直接在组织部分幻灯片上进行。

2. 为染色准备形式固定、石蜡嵌入部分

1. 获得准备好的正式固定，石蜡嵌入式组织部分。

脱蜡化

2. 将幻灯片浸入 100% 二甲苯中 2 次，每次 5 分钟。

补液

3. 将幻灯片浸入 100% 乙醇中 2 次，每次 3 分钟。
4. 将幻灯片浸入 95% 乙醇中 3 分钟。
5. 将幻灯片浸入 70% 乙醇中 3 分钟。
6. 将幻灯片浸入 50% 乙醇中 3 分钟。

阻断内源性过氧化物酶活性

7. 在室温下，在 100 mL 的 0.3% H₂O₂中孵育幻灯片 30 分钟。
8. 用 1X PBS 清洗幻灯片 2 次，每次 5 分钟。

抗原检索

9. 将幻灯片浸入 IHC 水酸盐缓冲液 （pH 6） 中，煮 20 分钟。
10. 组织幻灯片现已准备好进行染色。

3. 制备用于染色的新鲜冷冻、OTC 内嵌部分

1. 将 5 mm 的新鲜分离组织放入模具中，并加入 OCT，直到完全覆盖该部分。
2. 慢慢地将组织块浸入液氮中，直到完全冻结。样品现在可以在-80°C下储存长达1年。
3. 一旦准备切片，将冷冻组织块转移到冷冻，并允许整个设置达到-20°C。
4. 使用低温切割 5-10 μm 厚的组织部分，并使用刷子将截面直接放置在 IHC 兼容玻璃玻片上。
5. 让滑梯在室温下过夜干燥。幻灯片也可以存储在-80°C。
6. 在室温下将幻灯片浸入 250 mL 的 4% PFA 中 15 分钟，在染色前固定幻灯片。最佳固定方法应由用户确定。
7. 将幻灯片浸入 250 mL 的 1X PBS 2 次，每次 5 分钟。
8. 在室温下将幻灯片浸入 250 mL 的 0.3% H₂O₂中 30 分钟，以阻止任何内源性过氧化物酶活动。
9. 将幻灯片浸入 250 mL 的 1X PBS 2 次，每次 5 分钟。
10. 幻灯片现已准备好进行染色。

4. 染色

1. 使用阻隔笔用疏水屏障圈组织。

阻塞

2. 使用移液器，放置100 μL的阻塞缓冲液（马血清在1X PBS中稀释） - 在室温下在部分上放置1小时。
3. 使用移液器清除阻塞缓冲区。

初级抗体孵育

4. 在室温下用100μL稀释原抗体溶液（小鼠抗人环素D1在阻断缓冲液中稀释1:100）孵育被包围的组织30分钟。
5. 从每张幻灯片上排出原抗体，用 1X PBS 洗涤幻灯片 2 次，每次 5 分钟。

二次抗体孵育

6. 在室温下用100μL稀释的生物浸化二次抗体（生物浸化马抗小鼠IgG稀释1:200）孵育样品30分钟。
7. 去除二级抗体，从部分中排出，用1X PBS洗涤2次，每次5分钟。

色彩开发

8. 使用HRP进行可视化:加入100 μL的阿丁生物锡复合物（ABC）试剂，在室内温度下在暗中孵育30分钟
   注意:荧光标记的抗体也可以使用适当的显微镜进行可视化。
9. 用 1X PBS 清洗幻灯片 2 次，每次 5 分钟。
10. 通过在 DAB 的 100 μL 中孵育各部分，以长达 5 分钟进行开发幻灯片。
11. 在室温下加入蒸馏水（dH₂O）5分钟，停止发育。

反染色（如果需要）

12. 将幻灯片短暂浸入哈里斯血氧林溶液中（或0.5%甲基绿色，在0.1M醋酸钠（pH 4.2）中浸泡10分钟。
13. 用 dH₂O 洗涤幻灯片，每次洗涤 2 分钟，冲洗掉污渍。每次 5 分钟。

脱水

14. 将幻灯片浸入 95% 乙醇中 2 次，每次 5 分钟。
15. 将幻灯片浸入 100% 乙醇中 2 次，每次 5 分钟。
16. 将幻灯片浸入 100% 二甲苯中 2 次，每次 5 分钟。
17. 用纸巾把幻灯片擦干。

安装和盖玻片应用

18. 在幻灯片中添加一滴安装介质（如有机体-柠檬安装），并在各部分上放置一个盖玻片。

微观分析

19. 在适当的显微镜下观察染色部分进行分析。这里使用标准光学显微镜进行观察，安装数码相机进行成像。