يركز عملنا على تطوير واستخدام منهجية الجزيء الواحد لدراسة الديناميكيات في الأنظمة البيولوجية المعقدة. على وجه الخصوص ، نحن مهتمون بمعرفة كيفية تصرف بوليميرات الحمض النووي عند مواجهة حواجز الطرق ، في هذه الحالة ، G-quadruplexes. لقد طورنا طريقة جزيء واحد تعتمد على تصور التألق الذي يسمح لنا برؤية سلوك بوليميرات الحمض النووي الفردية عند مواجهة G-quadruplex.
من خلال فحصنا ، حددنا مسار تبادل غير مميز سابقا لدلتا بوليميراز الحمض النووي عند اصطدام G-quadruplexes ، حيث يسقط البوليميراز وسيعيد ارتباط ببوليميراز جديد. مع تطوير البروتوكول الخاص بنا ، أجبنا أخيرا على السؤال: كيف تتصرف بوليميرات الحمض النووي المختلفة عندما تواجه G-quadruplex ، كما يمكننا أن نرى في الوقت الفعلي كيف تتغير الحركية والميكانيكا بمرور الوقت؟ للبدء ، قم بإزالة زلة الغطاء الوظيفية من الفراغ وضعها على رف أنبوب صغير مملوء جزئيا بالماء لخلق بيئة رطبة.
ماصة 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت المانع في أنبوب ، ثم أضف 25 ميكرولتر من محلول NeutrAvidin واخلطها جيدا. انشر المحلول على سطح زلة الغطاء واتركه يحتضن لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الصندوق الرطب. بعد ذلك ، اغسل زلة الغطاء بالماء ، ثم جففها باستخدام غاز النيتروجين.
ضع كتلة بولي ديميثيل سيلوكسان مصنوعة خصيصا على زلة الغطاء داخل حامل خلية التدفق. أدخل أنابيب البولي إيثيلين في الفتحات الموجودة في خلية التدفق. الآن ، قم بتسخين حصصات ملليلتر واحد من المخزن المؤقت لحجب Tween ، و 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل ، ومخزن النسخ المتماثل إلى 40 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لتحرير الغازات من المحاليل.
قم بتفريغ المحاليل في غرفة مفرغة لمدة 15 دقيقة إضافية عند 800 مللي بار تحت الضغط الجوي. ضع قطرة من الزيت على الهدف. خذ خلية تدفق مبنية وضعها على مرحلة المجهر.
ثم ارفع الهدف لتلبية زلة الغطاء. أدخل أنبوب المدخل في المخزن المؤقت الذي يتم تفريغ الغاز Tween وقم بتوصيل المخرج بمضخة المحقنة. بعد ذلك ، اسحب المحقنة للخلف لسحب المخزن المؤقت لحظر Tween عبر الأنبوب إلى القناة.
قم بتدفق 200 ميكرولتر من مخزن الغسيل المخزن المؤقت منزوع الغازات في القناة بمعدل 100 ميكرولتر في الدقيقة لطرد المخزن المؤقت لحجب Tween. الآن ، قم بتخفيف محاليل قالب الحمض النووي إلى 0.5 بيكومولار في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للنسخ المتماثل. دع 150 ميكرولترا من المحلول يتدفق إلى القناة بمعدل 10 ميكرولتر في الدقيقة.
قم بإضاءة العينة باستخدام ليزر 647 نانومتر عند حوالي 900 مللي واط لكل سنتيمتر مربع في مستوى العينة لتصور قوالب الحمض النووي الفردية. بمجرد ظهور كثافة كافية من البقع ، تتدفق في محلول جديد من المخزن المؤقت للنسخ المتماثل لغسل الحمض النووي الزائد. انتقل إلى مجال رؤية جديد والتقط صورة للحمض النووي لتحديد درجة التموضع المشترك بين البوليميراز المسمى وركيزة الحمض النووي.
بمجرد الانتهاء ، قم بزيادة طاقة الليزر لتبييض البقع المتبقية. بعد ذلك ، قم بإعداد محلول بوليميراز يحتوي على dithiothreitol و dNTPs ومسبار فلوري في المخزن المؤقت للنسخ المتماثل. تدفق في 100 ميكرولتر من محلول البوليميراز بمعدل خمسة ميكرولتر في الدقيقة في القناة.
بمجرد أن تصبح العينة في بؤرة التركيز وضبط زاوية تألق الانعكاس الداخلي الإجمالية ، اضبط قوة الليزر لليزر 647 نانومتر على حوالي 900 مللي واط لكل سنتيمتر مربع في مستوى العينة. ابدأ تصوير مجال الرؤية للمدة الزمنية المطلوبة. منع تسلسل G-quadruplex تخليق دلتا البوليميراز كما يتضح من وجود نطاق 60 نيوكليوتيد في هلام الصفحة ، بينما أنتجت ركيزة التحكم بدون G-quadruplex نطاق 100 نيوكليوتيد.
أكد الفحص المجهري الفلوري أحادي الجزيء أن دلتا البوليميراز كان لها وقت سكون أقصر يبلغ ستة ثوان زائد أو ناقص ثانيتين على ركيزة G-quadruplex ، مقارنة بركيزة التحكم ، التي كان لها وقت سكون يبلغ 11 زائد أو ناقص ثلاث ثوان. كان عدد أحداث ربط دلتا البوليميراز أعلى بكثير على الركيزة G-quadruplex مقارنة بالتحكم ، مما يشير إلى دورات ربط وفك ربط متعددة بسبب حصار التوليف.
