تقييم ترسب الحديد في أدمغة الفئران 5xFAD بواسطة تلطيخ Perls / DAB

الهدف من هذا البروتوكول هو وصف كيفية تقييم كمية وتوزيع ترسب الحديد في أدمغة نموذج الفأر AD. في هذا البروتوكول ، نستخدم الفئران المعدلة وراثيا 5xFAD البالغة من العمر ثمانية أشهر كنموذج فأر AD ومقارنتها بالفئران البرية من نفس العمر. نقوم بتضمين تفاصيل إجراءات تحضير الكاشف الكيميائي ، وتقسيم الدماغ ، وإجراء تلطيخ Perls / DAB ، وتحليل الصور الناتجة.

قم بتخدير الماوس بشكل صحيح وتحقق من عمق التخدير والتسكين. اكشف قلبه ، ثم افتح الأذين الأيمن. حقن 20 مليلتر PBS و 4٪ PFA من البطين الأيسر بالتسلسل.

لاحظ أنه يجب ملاحظة هزات التثبيت. اقطع رأس الفأر واستخرج دماغه. ثم قم بإصلاح الدماغ في 4٪ PFA لمدة 12 إلى 24 ساعة.

اغمر الدماغ في 15٪ و 30٪ سكروز لمدة 12 إلى 24 ساعة. اقطع الدماغ سهميا من المنتصف واستخدم أي من النصف للتقسيم. قم بتركيب الدماغ على المقبض ، ضع حلقة من رقائق القصدير حول الدماغ ، وأضف OCT فيه لتضمين الدماغ.

اضبط سمك الأقسام ودرجة حرارة ناظم البرد. ثم قطع الدماغ. إذا تم طي الأقسام ، فاستخدم فرشا ناعمة لفتح الأقسام.

اجمع كل قسم إلى الشرائح باستخدام PBS ، ثم قم بإزالة الفقاعات الموجودة في القسم. حدد شريحة بها أنسجة دماغية سليمة وضعها في صندوق تلطيخ بلاستيكي مملوء ب PBS. ضع الصندوق على شاكر دوار مضبوطا على سرعة بطيئة لمدة خمس دقائق لشطف مركب OCT المتبقي جيدا.

تحضير 20 مل من 2٪ فروسيانيد البوتاسيوم وحجم متساو من 2٪ حمض الهيدروكلوريك. ثم امزجهم في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل. قم بتأمين الشريحة في الأنبوب باستخدام ملقط واحتضان الخليط في حمام مائي مسخن مسبقا عند 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

اغسل الشريحة باستخدام PBS وامسح السائل الزائد باستخدام المناديل الورقية. ضع الشريحة بشكل مسطح على مقعد المختبر وحتى ضع محلول DAB على الأنسجة باستخدام ماصة. احتضنها لمدة 10 دقائق لتعزيز تلطيخ بيرلز.

قم بإزالة محلول DAB الزائد واشطف المناديل عن طريق الغسيل ثلاث مرات باستخدام PBS. قم بتجفيف القسم بالتتابع في محاليل الكحول المتدرجة والزيلين لمدة ثلاث دقائق لكل منهما. قم بتغطية الأقسام بعلكة محايدة وقلة غطاء.

ثم اتركها تجف في غطاء الدخان. قم بتشغيل المجهر. اضبط سطوع مصدر الضوء.

ركز على قسم الدماغ تحت هدف تكبير 4X. حرك مرحلة المجهر للتركيز على المناطق ذات إشارات تلطيخ Perls / DAB العالية ، وخاصة الحصين والقشرة الدماغية. والتقاط الصور.

افتح الصورة الموضوعية بتكبير 10 ، ثم قم بتحويل تنسيق الصورة إلى تدرج رمادي 8 بت. تم تحويل القيم الرمادية للصورة إلى قيم OD ، ثم تم استخدام وظيفة العتبة لتغطية المناطق الإيجابية لتلطيخ Perls / DAB. حدد خيارات الإعداد التالية والأهم من ذلك ، حدد الحد إلى الحد لاستبعاد ضوضاء الخلفية.

أخيرا ، حدد القياسات للحصول على نتائج للتحليل الإحصائي. للتحقيق في توزيع وتراكم الحديد في نموذج فأر AD ، أجرينا تلطيخ Perls / DAB لأقسام الدماغ السهمية. لوحظت إشارات Perls / DAB عالية في الحصين والقشرة ، خاصة في الجزء الفرعي من الحصين للفئران 5xFAD ، في حين أظهرت أدمغة الفئران البرية التي تبلغ مدتها شهرين وثمانية أشهر إشارة أضعف.

أقل من 40 بالإضافة إلى التكبير ، تظهر الإشارة في الفئران 5xFAD في هياكل تشبه لويحات A-beta ، بما يتفق مع الدراسات السابقة. توضح هذه النتائج فعالية مكانة Perls / DAB كتقنية كيميائية نسيجية للكشف عن الحديد. نعرض أيضا حالتين من التلوين الفاشل.

سيؤدي التغطية المفرطة أو الجفاف غير المناسب إلى هذه الحالات. يوفر تلطيخ Perls / DAB إشارة أقوى وتباينا أفضل في الخلفية من تلطيخ Perls التقليدي ، مما يجعل اكتشاف الحديد أكثر حساسية ودقة. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يكتشف الحديد الحديديك في مجمعات البروتين غير المرتبطة.

الحديد المرتبط بقوة ، كما هو الحال في الهيموجلوبين ، لن يتفاعل. هذا يقلل بشكل كبير من الإشارات غير المرغوب فيها التي يسببها الحديد في خلايا الدم الحمراء والهيموجلوبين. بشكل عام ، يعد تلطيخ Perls / DAB مناسبا للتجارب على والتحقيقات المرضية التي تتطلب خصوصية وسطية وحساسية.

يوفر للباحثين طريقة لتصور تراكم الحديد وتحديده على حساب وقت وتكلفة أقل.