الهدف الرئيسي من هذا الإجراء هو تنفيذ بروتوكول شامل لثقافة وتوصيف الميكروفاج على أسطح الزرع المختلفة وتوصيف الأنواع الفرعية للميكروفاج. يتم استخدام عدة طرق كجزء من هذا التوصيف ، بما في ذلك qRT-PCR و EISA و CLSM ، لتحديد ملامح التعبير الجيني والبروتينات الإفرازية وعلامات سطح الخلية. تظهر النتائج فائدة وفعالية البروتوكول المنفذ في استقطاب الميكروفاج وأسطح الزرع، وتحديدها بدقة بناء على التعبير الجيني والبروتينات المفرزة وعلامات سطح الخلية.
علاوة على ذلك ، تصف العلامات أنماط التعبير المتسقة والمحددة للتمرد والتي يمكن استخدامها للتمييز بين الأنواع الفرعية المختلفة من MDMs. بشكل عام ، ستساهم الدراسة في تطوير وتصميم مواد معدلة للمناعة لتحسين وتعزيز عمليات تجديد الأنسجة الناجحة ، ومنع الالتهاب المزمن المرتبط بالزرع ، وتعزيز تكامل الزرع الناجح. للبدء ، قم بإعادة تعليق الخلايا أحادية النواة للدم المحيطي البشري المعزولة في 15 مل من وسط ربط الخلايا الأحادية الدافئ مسبقا ، ونقلها إلى قارورة ثقافة الخلايا T-75.
احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 90 دقيقة للالتصاق. بعد الحضانة ، تخلص من المادة الطافية ، واغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام RPMI 1640 Medium الدافئ مسبقا ، مع استكمال 10٪ FBS و 1٪ بنسلين والستربتومايسين عن طريق إمالة القارورة برفق لإزالة الخلايا غير الملتصقة أو غير الملتصقة بشكل فضفاض. أضف 15 ملليلترا من الوسط الكامل الذي يحتوي على 10 نانوغرام لكل مليلتر من مستعمرة البلاعم العامل المحفز للخلايا الملتصقة.
واحتضان لمدة ستة أيام لتعزيز التمايز. بعد التمايز ، قم بإزالة وسط الثقافة من القارورة واغسل الخلايا ب 10 مل من PBS لمدة خمس دقائق. لفصل خلايا الالتصاق ، أضف 10 مل من محلول انفصال الخلايا الدافئ مسبقا واحتضنه لمدة 30 دقيقة.
ثم اضغط برفق على القارورة لتحرير الخلايا ونقلها إلى أنبوب سعة 50 ملليلترا. لفصل الخلايا المتبقية ، أضف 10 ملليلتر من PBS إلى القارورة وتخلص من الخلايا. انقل الخلايا المنفصلة إلى أنبوب سعة 50 ملليلترا.
قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية المنفصل عند 300 جرام لمدة 10 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية قبل تعليق الخلايا في خمسة ملليلتر من الوسط الكامل الدافئ مسبقا. باستخدام تلطيخ التريبان الأزرق ، احسب الخلايا على مقياس الدم لتحديد عدد الخلايا وقابليتها للحياة. قم بإعداد تعليق الخلية عن طريق ضبط رقم الخلية إلى 160،000 خلية لكل مليلتر واحد من الوسط الكامل.
بعد ذلك ، قم بتنظيف أقراص المواد الحيوية بالموجات فوق الصوتية في 70٪ من الإيثانول لمدة خمس دقائق ، متبوعا بالتعقيم بنسبة 70٪ من الإيثانول لمدة 30 دقيقة. بعد تجفيف أقراص التيتانيوم ، ضعها في طبق غير معالج من 24 بئرا وأضف ملليلترا واحدا من معلق الخلية المحضر إلى كل بئر. احتضان الخلايا لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون للحصول على البلاعم M0.
للحصول على البلاعم المستقطبة M1 ، أضف الإنترفيرون جاما وعديد السكاريد الدهني في آبار صفيحة 24 بئرا. بالنسبة لاستقطاب M2 ، أضف إنترلوكين -4 وإنترلوكين -13. احتضان الخلايا لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون للحث على الاستقطاب.
بعد الحصول على البلاعم المستقطبة المشتقة من الخلايا الوحيدة المستقطبة من خلايا الدم المحيطية البشرية أحادية النواة ، اجمع المادة الطافية للخلية في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر. انقل قرص التيتانيوم إلى طبق جديد سعة 24 بئرا. قم بالطرد المركزي للخلية الطافية عند 300 جرام لمدة خمس دقائق وانقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد.
قم بقياس السيتوكينات والكيموكينات عند 450 نانومتر وفقا للتعليمات المحددة المقدمة من الشركة المصنعة. احسب تركيز السيتوكينات المفرزة أو الكيموكينات باستخدام المنحنى القياسي. قم بقياس كمية البروتين الإجمالية باستخدام مجموعة فحص بروتين حمض البيسنشونيك.
تطبيع تركيز البروتينات المفرزة إلى ملليغرام من البروتين الكلي. اغسل البلاعم المستقطبة مرتين في 800 ميكرولتر من PBS. احتضان الأقراص في 400 ميكرولتر من مخزن التثبيت المؤقت لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
بعد إزالة المخزن المؤقت للتثبيت ، اغسل الأقراص ثلاث مرات في 400 ميكرولتر من PBS. الآن ، احتضان الأقراص ب 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحجب لمدة 30 دقيقة لمنع مواقع الربط غير المحددة. تخلص من المخزن المؤقت للحجب واحتضان الأقراص لمدة ساعة واحدة باستخدام الأجسام المضادة الأولية المخففة في 400 ميكرولتر من محلول التلوين.
بعد ساعة واحدة ، قم بإزالة الأجسام المضادة الأولية واغسل الأقراص ثلاث مرات باستخدام 400 ميكرولتر من محلول الغسيل. أضف الفلور للأجسام المضادة الثانوية المخففة في مخزن التلوين واحتضانها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. بعد الحضانة ، اغسل العينات ثلاث مرات في مخزن الغسيل لمدة ثلاث دقائق لكل منها.
أضف 10 مللي مولار DRAQ5 في PBS واحتضنه لمدة 15 دقيقة في الظلام. ثم قم بإزالة المادة الطافية واغسل الأقراص مرة واحدة باستخدام PBS. أضف قطرة واحدة من وسط التثبيت ، وبعد خمس دقائق ، ضع أكواب الغطاء واترك العينات تجف لمدة ساعة واحدة.
بعد التجفيف ، أغلق الحواف بطلاء أظافر شفاف. للحصول على نظرة عامة على الخلايا ، قم بتصوير العينات على مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر تحت تكبير 25X. قم بتغيير التكبير إلى 63X لتحديد بنية علامات السطح وتوطينها.
تم استقطاب البلاعم الأولية المشتقة من الخلايا الأحادية بنجاح إلى البلاعم M1 و M2 على أسطح التيتانيوم ، مع التعبير عن CCR7 بقوة أكبر في الضامة M1 و CD209 في البلاعم M2. أظهر تحليل qRT-PCR استقطابا ناجحا للبلاعم الأولية المشتقة من الخلايا الوحيدة على كل من التيتانيوم وأسطح انزلاق الغطاء مع تعبير عال عن CCR7 و TNF-alpha ل M1 و CD209 و CCL13 ل M2. أكدت المستويات العالية من سيتوكين TNF-alpha الالتهابي و CCL13 chemokine استقطاب M1 و M2 على مستوى البروتين.
