يركز بحثنا على خصائص ووظيفة نقل الغشاء ، وتحديدا ناقلات الأيونات والقنوات مثل قنوات الأنيون والأوسموليت المشكلة من LRRC8. نحن نحقق في آلياتها الفيزيائية الحيوية والعمليات التنظيمية والوظائف الفسيولوجية للخلية. في النهاية ، نهدف أيضا إلى توضيح كيف يمكن أن يؤدي الخلل الوظيفي لديهم إلى اضطرابات في البشر.
طورت العديد من المختبرات فهمنا لقنوات LRRC ، وحل هياكل مجمعات LRRC8 ، وتوضيح الخصائص الفيزيولوجية الكهربية ، والكشف عن الأدوار الفسيولوجية المتنوعة. ومع ذلك ، يبقى سؤال حاسم: كيف يتم تنظيم هذه القنوات كيميائيا حيويا وفسيولوجيا وكيف يؤثر تكوين الوحدة الفرعية على تنشيطها وأدوارها داخل الخلية؟ تسمح هذه الطريقة بمراقبة نشاط قناة LRRC8 في مقصورات يتعذر الوصول إليها عادة للفيزيولوجيا الكهربية مثل المقصورات داخل الخلايا دون إزعاج التركيب العصاري الخلوي مثل مشبك التصحيح للخلية بأكملها.
تتيح دقة الخلايا الفرعية مراقبة قنوات LRRC8 التي يتم تنشيطها تفاضليا داخل خلية واحدة وتسمح بالمراقبة المستمرة أثناء العمليات الفسيولوجية. باستخدام هذا المستشعر القائم على FRET ، سوف نحقق في تنظيم ووظيفة قنوات LRRC8 VRAC في ظل ظروف فسيولوجية مختلفة. الأسئلة الرئيسية هي: كيف تعيد الوحدات الفرعية ترتيب تأكيدها. ما هي عمليات نقل الإشارة التي تشارك في محفزات مختلفة ، وما إذا كانت هناك اختلافات بين المعلمات المختلفة ل LRRC8 ؛ وما إذا كانت هناك اختلافات تحت الخلوية في العمليات الفسيولوجية.
للبدء ، قم بإعداد المخازن المؤقتة متساوية التوتر ، ونقص التوتر ، ومفرطة التوتر. باستخدام مقياس التناضح ، قم بقياس الأسمولية للمخزن المؤقت. في اليوم السابق للتعداء ، قم بالبذور واحدة في عشرة أس خمس خلايا HeLa في ملليلترين من وسط زراعة الخلايا على طبق 35 ملم.
استزراع الخلايا بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي ، بالتنقيط ، أضف محلول التعداء بحركة حلزونية إلى الطبق. حرك الطبق خمس مرات أفقيا وعموديا على سطح المقعد لخلط المحلول.
استزراع الخلايا بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي ، تحقق من عدم تعداء تحت المجهر الفلوري. خذ الخلايا التي تعبر عن كل من تركيبات المتبرع والمتلقي واستنشق وسط زراعة الخلايا.
اغسل الخلايا ثلاث مرات بملليلترين من المخزن المؤقت متساوي التوتر. بعد شفط المخزن المؤقت متساوي التوتر ، أضف ثلاثة ملليلتر من المخزن المؤقت متساوي التوتر إلى الخلايا وضع طبق العينة على مرحلة المجهر. تحميل إعدادات FRET للفحص المجهري أو إعداد القنوات اللازمة لتجربة FRET: انبعاث الإثارة المانحة ، DD ؛ المتبرع المتقبل ، DA ؛ والمتقبل والمتقبل ، AA. ابحث عن مجال رؤية به خلية واحدة على الأقل تعبر عن كل من بنى المتبرع والمستقبل واضبط إعدادات القناة إذا لزم الأمر.
قم بإزالة اللوحة من مرحلة المجهر وضعها مرة أخرى في الحاضنة حتى التجربة. خذ الخلايا التي تعبر عن بناء المتبرع فقط واستنشق وسط الثقافة. اغسل الخلايا ثلاث مرات بملليلترين من المخزن المؤقت متساوي التوتر.
بعد الغسيل الأخير ، أضف ثلاثة ملليلتر من المخزن المؤقت متساوي التوتر إلى الخلايا وضع طبق العينة على مرحلة المجهر. ابحث عن مجال رؤية به خلية واحدة على الأقل تعبر عن بنية المتبرع. قم بتصوير جميع قنوات المتبرع والمتبرع والمتقبل والمتبرع والمتقبل.
ارسم منطقة اهتمام أو عائد استثمار حول الخلايا وقياس متوسط شدة قنوات المتبرع - المستقبل والمتبرع - المتبرع. لطرح الخلفية ، ارسم عائد استثمار في قنوات المتبرع - المستقبل والمتبرع - المتبرع حيث توجد إشارة الخلفية فقط وقم بقياس متوسط الشدة. بعد تصوير الخلايا ، ارسم عائد استثمار حول الخلايا وقم بقياس متوسط شدة قناة المتبرع والمستقبل والمستقبل.
لطرح الخلفية ، ارسم عائد استثمار في قنوات المانح - المستقبل والمستقبل - حيث توجد إشارة الخلفية فقط وقم بقياس متوسط الشدة. أخيرا ، احسب عوامل التصحيح ، بيتا وجاما ، باستخدام القيم المحددة ل IDA المصححة في الخلفية ، و IDD المصحح في الخلفية ، و IAA المصحح في الخلفية. للبدء ، استنشق المخزن المؤقت من خلايا HeLa المعدة مسبقا والتي تعبر عن المتبرع والمتقبل.
اغسل الخلايا بثلاثة ملليلتر من المخزن المؤقت متساوي التوتر وضع طبق العينة على مرحلة المجهر. لشفط المخزن المؤقت متساوي التوتر ، قم بإصلاح وضبط قنية الخرطوم بحيث يصل طرفها إلى قاع الطبق. لإضافة مخازن مؤقتة ، قم بإصلاح الأنبوب وضبطه للسماح بتدفق العازلة المدفوع بالجاذبية بالسقوط في الطبق.
ابحث عن مجال رؤية به خلية واحدة على الأقل تعبر عن بناء المتبرع والمتلقي في وقت واحد واحصل على صورة. لطرح الخلفية لإشارة FRET ، ارسم عائد استثمار في قناة المانح - المستقبل حيث توجد إشارة الخلفية فقط وقم بقياس متوسط الشدة. من أجل القياس الكمي SE-FRET ، ارسم عائد استثمار حول الخلية وقم بقياس متوسط الشدة في قنوات المتبرع والمتبرع والمتقبل والمستقبل لجميع الصور في السلسلة الزمنية.
قم بإعداد تجربة بفاصل زمني للقنوات المتبرع والمتبرع والمتقبل والمستقبل بفاصل زمني مدته 10 ثوان ومدة لتغطية جميع شروط تسلسل التحفيز. ابدأ في الحصول على التصوير بفاصل زمني ورسم آثار SE-FRET. بعد قياس خط الأساس ، استبدل المخزن المؤقت بتدفق الجاذبية.
في التجربة الحية ، قم بشفط المخزن المؤقت متساوي التوتر عبر قنية الخرطوم ، مع تطبيق فراغ باستخدام حقنة. أضف ثلاثة ملليلتر من المخزن المؤقت للحالة التالية عن طريق تدفق الجاذبية مع الاستمرار في التصوير بفاصل زمني. لقياس حالة أخرى، اغسل العينة في المخزن المؤقت التالي كما هو موضح سابقا مع متابعة التصوير بفاصل زمني.
باستخدام الطريقة القائمة على FRET ، تمت مراقبة نشاط قناة الأنيون LRRC8 المنظمة بالحجم أثناء التحفيز التناضحي ويرتبط تقليل SE-FRET بنقص التوتر خارج الخلية. في تجارب أخرى ، تم أيضا اكتشاف تنشيط LRRC8 VRAC عن طريق المحفزات متساوية الحساسية مثل إشارات ثنائي الجلسرين أو تنشيط الخلايا العضلية. تمت مراقبة نشاط LRRC8 VRAC عند تحريض موت الخلايا المبرمج في خلايا HeLa التي تعبر عن LRRC8A mCerulean3 و LRRC8E mVenus.
تسبب عامل نخر الورم ألفا وسيكلوهيكسيميد في انخفاض قوي في SE-FRET ، والذي تعافى في وسط مفرط التوتر. لم يقلل علاج DMSO من SE-FRET، مما يؤكد خصوصية LRRC8 VRAC.
