ستسهل هذه الطريقة البحث في التكاثر الجنسي في أرابيدوبسيس من خلال السماح بمراقبة تفاعلات النبات المشيجي بكفاءة عالية وبعدد كبير من حجم العينة لكل جلسة تصوير. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي الحفاظ على البويضات على الحاجز ، وتزداد كمية وتقبل البويضات بشكل كبير عن الطرق السابقة. يمكن أن تكون تقنية التشريح صعبة في البداية وتتطلب يدا ثابتة.
لذلك ، يوصى بالتدرب عدة مرات على المدقات المخصوبة قبل البدء في التجربة. ابدأ بإعداد وسط إنبات حبوب اللقاح كما هو موضح في النص. بعد ذوبان الآجار تماما ، ماصة 130 ميكرولتر من الوسط في بئر 14 ملم من طبق قاع زجاجي 35 ملم.
قم بتدوير الطبق حتى يغطي الوسيط البئر. نضح 40 ميكرولتر من الوسط من وسط الطبق باستخدام ماصة ، تاركا وراءه 90 ميكرولترا من الوسط. لضمان تبريد متساو للوسط ، قم بتبريد الطبق على كتلة من الألومنيوم في غرفة الرطوبة قبل تخزين الألواح عند أربع درجات مئوية طوال الليل.
في صباح اليوم السابق للتصوير ، اختر نباتات أرابيدوبسيس الصحية التي بدأت مؤخرا في الإنتاج كمتبرعين بالحاجز ومتبرعين بالوصم. قم بإزالة الزهور القديمة على الإزهار قبل إضعاف الأزهار المانحة للحاجز 12B المكونة من ثلاث مراحل و 12 من المرحلة 12B من الزهور المانحة للوصمة عن طريق إزالة الأسدية والكؤوس والبتلات. في الصباح بعد 24 ساعة ، قم بتلقيح المتبرعين بالوصمة بالزهور المانحة لحبوب اللقاح التي تتساقط حبوب اللقاح بسهولة.
يكتمل التلقيح عندما تكون الوصمات مغطاة بالكامل تقريبا بحبوب اللقاح. بعد 30 دقيقة من التلقيح ، قم بإزالة مدقة متبرع بالحاجز الصحي والناضج من عنيق وضعه في شريط لاصق جديد على الوجهين مثبت على شريحة زجاجية مع لصق وصمة العار قبالة حافة الشريط. ثبت المدقة بإحكام على الشريط عن طريق الضغط برفق على عنيق وعلى طول المبيض باستخدام الجانب الخلفي من إبرة حقنة الأنسولين الجديدة.
قم بإزالة بقايا حطام الكؤوس والبتلات والسداة من الإخصاء. تحت منظار مجسم ، استخدم إبرة حقنة الأنسولين لعمل قطعتين لكل كربل عند تقاطع نمط المبيض وتقاطع المبيض عنيق. ثم قم بعمل جروح ضحلة على طول حاجز كل كربل وقشر جدران المبيض على الشريط ، وفضح البويضات.
حرك الإبرة برفق بين الحاجزين لقطع البرقوق على طول المدقة بالكامل دون إزعاج البويضات. ثم اقطع الحاجز العلوي بالقرب من النمط حتى يرفع الحاجز بالكامل. بعد ذلك ، قم بإزالة الحاجز من عنيق باستخدام ملقط.
ضع الحاجز بشكل مسطح قدر الإمكان على الوسط مع توجيه الأكوام الدقيقة للبويضات لأعلى. ثم اضغطي على الحاجز برفق حتى تندمج البويضات قليلا في الوسط. ضع المدقات المانحة للوصمة الملقحة على شريط لاصق جديد على الوجهين مثبت على شريحة زجاجية بحيث يكون التقاطع على شكل المبيض بعيدا عن حافة الشريط.
قص النمط بشكل مستقيم باستخدام شفرة حلاقة وارفعه بعيدا مع وصمة العار المرتبطة بالشفرة. أزيلي وصمة العار من الشفرة باستخدام إبرة حقنة الأنسولين وضعيها على بعد حوالي 250 إلى 300 ميكرومتر من البويضات. نقل ما يصل إلى 12 وصمة، ووضع اثنين على جانبي كل حاجز.
بعد الحضانة في غرفة الرطوبة على المجهر الذي يتم الحفاظ عليه عند 92٪ رطوبة نسبية في 21 درجة مئوية ، يكون الطبق جاهزا للتصوير. ضع العينات في بؤرة التركيز تحت برايت فيلد بكثافة إضاءة منخفضة ، ثم انتقل إلى ضوء الفلورسنت. بعد ذلك ، ضع علامة على مناطق العينة في نظرة عامة على المرحلة المراد تصويرها.
بمجرد الانتهاء من ذلك ، ابدأ التصوير باستخدام مخطط اكتساب متعدد المراحل مع وظيفة التركيز التلقائي في بداية كل منطقة نظرة عامة. بعد حوالي سبع إلى تسع ساعات من الحضانة ، تحقق لمعرفة ما إذا كانت أنابيب حبوب اللقاح قد انجذبت إليها البويضات واستقبلتها. يظهر استقبال أنبوب حبوب اللقاح الناجح انفجارا متفجرا لأنبوب حبوب اللقاح في الكومة الدقيقة للبويضات.
عند الانتهاء ، أوقف الاستحواذ. تم إجراء ثمانية نسخ تقنية مكررة لطريقة البويضات شبه المستأصلة في المختبر وسجلت لاستقبال أنبوب حبوب اللقاح بنجاح. تظهر المربعات الخضراء استقبالا ناجحا وتظهر المربعات الحمراء استقبالا معيبا.
كشفت هذه التجارب أن حوالي 28٪ من البويضات تظهر انفجار أنبوب حبوب اللقاح المتفجر ، مما أدى إلى كفاءة تتراوح من حوالي 10 إلى 50٪ باستخدام طريقة شبه الحاجز في المختبر ، تم تسجيل العديد من بويضات الجعة وتم تسجيل ما يصل إلى 40 حالة من استقبال أنبوب حبوب اللقاح الناجح في جلسة تصوير واحدة كما هو موضح في البويضات ذات المربعات الخضراء. أظهرت خمس نسخ تقنية مكررة لهذه الطريقة أن ما يقرب من 79٪ من البويضات التي تجذب أنابيب حبوب اللقاح تظهر انفجار أنبوب حبوب اللقاح المتفجر ، مما يؤدي إلى كفاءة تتراوح من حوالي 70 إلى 100٪ عند تمزق أنبوب حبوب اللقاح ، لوحظ أن نواة التآزر المستقبلي تتحلل في نفس الوقت بدقة دقيقة واحدة. بعد زواج النواة ، شوهدت هجرة نواة خلية البويضة نحو الميكروكومة.
كان كل من التآزر الأيسر والأيمن قادرا على العمل كتآزر استقبالي. العوامل الحاسمة التي يجب الانتباه إليها للنجاح في هذه الطريقة هي التدريج ، باستخدام وسط طازج ، وتضمين البويضات في الوسط ، والحفاظ على رطوبة عالية ، وضمان سمية ضوئية منخفضة. يمكن للمرء أيضا إقران هذه التقنية بتصوير الإثارة ثنائي الفوتون لمراقبة التغيرات الفسيولوجية والخلوية التي تحدث أثناء تفاعلات النباتات المشيجية عن كثب.
يمكن للمرء أيضا إقران هذا بالمجهر الإلكتروني عن طريق تثبيت البويضات.
