كان الهدف من هذا البروتوكول هو إنشاء نموذج في المختبر لدراسة الخواص الميكانيكية للغضروف المفصلي أثناء بداية وتطور هشاشة العظام. الميزة الرئيسية للتقنية الحالية هي أن نباتات الغضروف سهلة التوليد وممثلة بشكل كبير لغضروف العمر الأصلي. يمكن استخدام هذا النموذج لتحليل ومراقبة مختلف هشاشة العظام والتشخيص والأساليب العلاجية على المستوى الميكانيكي الحيوي.
للبدء ، اقطع الغضروف بعيدا عن العظم باستخدام مشرط. باستخدام لكمة خزعة ، قم بإنشاء أقراص قطرها أربعة ملليمترات. ضع القرص على جهاز قطع مخصص.
باستخدام ملعقة ، قم بإصلاح وتثبيت قرص الغضروف. قطع القرص الغضروفي بشفرة الحلاقة. باستخدام ملعقة ، اجمع القرص وضعه في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر.
للبقاء في عينات الغضروف ، أضف 130 ميكرولترا من صبغة مضان نفاذية للخلايا إلى كل بئر من 96 صفيحة بئر ووزع القرص على اللوحة كقرص واحد لكل بئر. ضع لوحة البئر 96 على حامل لوحة المجهر الفلوري. حدد مرشح التألق المناسب والهدف.
ضع الهدف أسفل البئر المحدد مسبقا الذي يحتوي على غضروف فردي. ركز على القرص لرؤية النمط الخلوي. حدد وظيفة الملاح للحصول على نظرة عامة على البئر بالكامل.
استخدم زر الماوس الأيسر واسحبه للانتقال إلى موضع مرحلة مختلف. حدد مربعا يشمل منطقة الاهتمام المراد مسحها ضوئيا. حدد خيار نقطة تركيز خريطة البرنامج ثم حدد كل بلاطة فردية بالنقر بزر الماوس الأيسر في وسطها.
حدد خريطة تركيز الخيار في النافذة الظاهرة مع جميع المربعات المحددة مسبقا. انقر نقرا مزدوجا فوق البلاط لعرضه وجعله في التركيز المناسب. بعد ذلك ، انقر فوق تعيين Z لحفظ الخطة البؤرية والمتابعة إلى التجانب التالي.
بعد ضبط الخطة البؤرية لكل بلاطة فردية ، ابدأ الحصول على الصورة بالضغط على بدء المسح الضوئي. قم بإصلاح كل قرص غضروفي محدد مسبقا يحتوي على نمط خلوي في أطباق بتري عن طريق إضافة غراء متوافق حيويا كافيا على الجوانب العلوية والسفلية واليسرى واليمنى من القرص. قم بتغطية الأقراص ب 2.5 ملليلتر من وسط Leibovitz بدون L-glutamine.
ضع طبق بتري في حامل عينات أجهزة AFM. لمعايرة الكابولي AFM ، ضعه على سطح ناتئ الكتلة الزجاجية بحيث يستقر على المستوى البصري المصقول في وسط الكتلة الزجاجية. اخفض الكابولي في خطوات 100 ميكرومتر باستخدام وظيفة محرك السائر حتى يتم غمره بالكامل في الوسط.
لتحديد موقع قياس الغضروف المطلوب ، ابدأ نهج الماسح الضوئي باستخدام الكابولي على منطقة خالية من العينات النظيفة من طبق بتري. ثم اسحب الكابولي على بعد 1.5 ملم من أسفل اللوحة. قم بالتبديل من عرض برايتفيلد إلى عرض مضان وحدد الجزء العلوي من القرص بصريا.
حرك حامل عينة AFM بالضبط مليمترين باتجاه منتصف القرص. قم بتشغيل نهج الماسح الضوئي للوصول إلى سطح قرص الغضروف وسحب الكابولي بمقدار 100 ميكرومتر. لتوليد منحنى مسافة القوة ، ركز على الخلايا الموضوعة في موقع القياس المطلوب.
انقر فوق زر التشغيل لبدء القياسات والحصول على خمسة منحنيات لمسافة القوة في كل موقع قياس. احفظ المنحنيات بمجرد فحصها. لتقدير معامل يونغ ، باستخدام خيار فتح مجموعة من منحنيات التحليل الطيفي ، افتح منحنيات مسافة القوة المتولدة ليتم تحليلها.
حدد طراز Hertz-fit متبوعا بخيار ملاءمة المرونة. ثم تصور وتوثيق معامل يونغ. التكيف باستخدام نسبة بواسون 0.5 ونصف قطر طرف الكابولي المناسب.
ثم تحقق بصريا من ملاءمة منحنى مسافة القوة لضمان صحتها. لتحديد عمق المسافة البادئة ، افتح كل من منحنيات مسافة القوة المتولدة في برنامج تحليل البيانات وحدد نموذج Hertz-fit كعملية تحليل. قم بتطبيق خيار إزاحة خط الأساس المطروح على صفر محور الانحراف الرأسي وحدد دالة الإزاحة زائد الإمالة.
استخدم وظيفة البحث عن نقطة اتصال لتحديد نقطة الاتصال تلقائيا. باستخدام دالة موضع الطرف الرأسي ، اطرح المسافة التي تمثل فقط انحراف الكابولي من ارتفاع بيزو الخام أثناء المسافة البادئة. حدد خيار ملاءمة المرونة لعرض منحنى مسافة القوة المعالجة.
ثم حدد مساحة الرسم البياني بحيث تصطف مع القيمة الأكثر سالبة على محور موضع الطرف الرأسي. في علامة تبويب المعلمات من مربع XMIN، اقرأ المسافة البادئة وقم بتوثيقها. أظهرت الأقراص التي تحتوي على سلاسل مفردة قيم صلابة أعلى بمتوسط 2.6 كيلو باسكال ، وهو ما يمثل مناطق الغضاريف الصحية غير المنقوصة.
مع بداية هشاشة العظام وتطورها ، أظهرت قياسات AFM انخفاضا قويا متدرجا في الصلابة بنسبة 42٪ في الأوتار المزدوجة ، و 77٪ في المجموعات الصغيرة ، وفي النهاية 88٪ في المراحل المتقدمة التي تمثلها المجموعات الكبيرة. الأقراص التي تحتوي على نمط منتشر معروضة بمرونة عالية مع اختلاف مهم في القيم الفردية لمعامل يونغ. بالنسبة لجميع أقراص الغضاريف ذات تنظيم النمط الخلوي السائد المعين ، وجد أن عمق المسافة البادئة المرتبط بنقطة الضبط المستخدمة يتناسب عكسيا مع الصلابة.
تشير القطع الأثرية التي شوهدت في منحنيات مسافة القوة المتولدة إما إلى اتصال دون المستوى الأمثل بين ناتئ AFM وسطح الغضروف أو تثبيت عينة غير صحيح لطبق بتري. يمكن معالجة غضاريف الغضاريف وتحليلها باستخدام مجموعة متنوعة من التقنيات البيولوجية الجزيئية مثل تحليل البروتين عبر إليزا ، أو وضع العلامات المناعية ، أو التعديل الغربي ، أو التحليل العام عبر تفاعل البوليميراز المتسلسل. يمكن استخدام هذه الطريقة لدراسة التأثير المباشر للعلاجات الجديدة على الغضروف المفصلي وقد تساعد الباحثين على اكتساب رؤى مهمة حول آليات التهاب المفاصل العظمي.
