يصف بروتوكولنا طريقة طحن دقيقة عالية الدقة لتصنيع جهاز موائع دقيقة أكريليك للكشف المناعي الكمي لتركيزات التحليل المماثلة لتقنية ELISA القياسية الذهبية. أبرز ما في الأمر هو تصنيع جهاز ميكروفلويديك بسيط ومنخفض التكلفة بالحرارة بدون غرفة نظيفة ، مما يسمح بأوقات فحص أقصر وحدود كشف جيدة بطريقة كمية. ابدأ بطحن السطح.
قطع مستطيلات 9 × 25 ملم بسمك 1.3 ملم PMMA مع بت مطحنة نهاية 800 ميكرومتر. قم بتوصيل أحد هذه المستطيلات بعناية بشريط لاصق على الوجهين بالمنصة الكهرضغطية. قم بتوصيل ووضع مستشعر Z على سطح مستطيل PMMA.
حدد دبوس الكشف وحركه فوق سطح المستشعر. اخفض الدبوس يدويا دون الاتصال بالمستشعر. قم بتنشيط وضع استشعار Z-zero.
قم بتدوير بت مطحنة نهاية 200 ميكرومتر عند 14،500 دورة في الدقيقة. قم بخفضه ببطء إلى إحداثيات الأصل على المحور z. ثم أعد ضبط المحور z 30 ميكرومتر أسفل الأصل.
قم بتعيين هذا الإحداثي على أنه أصل Z الجديد. انقر فوق الزر Cut في برنامج آلة الطحن الدقيقة لتنشيط لوحة القطع. انقر فوق الزر "إضافة" وحدد ملف TXT برمز تم إنشاؤه مسبقا لطحن سطح الأكريليك.
انقر فوق الزر "إخراج" لبدء العملية. لطحن قيود الخمسة ميكرومتر ، أولا ، اضبط سرعة دوران بت المطحنة النهائية على 11،000 دورة في الدقيقة. بعد ذلك ، ارفع المنصة بمقدار 6.5 ميكرومتر باستخدام واجهة المنصة الكهرضغطية.
حرك بت مطحنة النهاية على طول المحور ص بمقدار 500 ميكرومتر. أعد المنصة الكهرضغطية إلى قيمتها الأولية على المحور z باستخدام واجهة التحكم. بعد ذلك ، قم بإجراء طحن القنوات الدقيقة عن طريق فتح ملف التصميم الذي تم إنشاؤه مسبقا من برنامج التصميم.
انقر فوق الزر "طباعة" ، وقم بالوصول إلى قائمة الخصائص وانقر فوق نافذة الألوان المقابلة للطبقة التي تحتوي على التصميم المراد تشكيله. اضبط معلمات التصنيع في لوحة الأدوات. لطحن الثقوب ، قم بالتبديل إلى بت مطحنة نهاية 800 ميكرومتر.
قم بتنشيط طبقة التصميم للثقوب التي يبلغ قطرها 1.2 ملم من خلال النقر على نافذة الألوان المقابلة وتحديد معلمات التصنيع المقابلة. قم بتصنيع فتحتين إضافيتين في الزوايا المقابلة للمستطيل لمحاذاة الأكريليك بطريقة مقلوبة على منصة جديدة. اقلب الأكريليك وألصقه بشريط لاصق على الوجهين فوق المحول باستخدام الأعمدة المشكلة.
افتح الملف بتصميم الثقوب للوجه المقابل من برنامج التصميم. قم بطحن النصف المتبقي من فتحات مدخل ومخرج الكاشف بقطر 1.5 ملم وعمق 0.7 ملم. نظف كل من صفائح مستطيل الأكريليك بكحول الأيزوبروبيل واشطفه بالماء المقطر.
اغمر الأكريليك في حمام بالموجات فوق الصوتية لمدة 10 دقائق. جفف كل من صفائح الأكريليك وألصقها بداخل غطاء طبق بتري زجاجي بشريط على الوجهين. ثم ضع قاعدة طبق بتري الزجاجي داخل طبق بتري زجاجي أكبر.
صب ملليلتر واحد من الكلوروفورم في قاعدة طبق بتري ووضع الغطاء بسرعة مع صفائح الاكريليك. أضف الماء المقطر على الفور إلى قاعدة طبق بتري الأكبر حتى مستوى غطاء طبق بتري. السماح بتعريض الأكريليك لغاز الكلوروفورم لمدة دقيقة واحدة.
ثم قم بإمالة طبق بتري لكسر ختم الماء وكشف طبق بتري على الفور. للترابط ، قم بمحاذاة كلا الأكريليك مع الجوانب المكشوفة للكلوروفورم وجها لوجه وشكل شطيرة. ضع الأكريليك في المكبس لمدة دقيقتين ، مع تغيير محاذاة الأكريليك.
ثم قم بتوصيل اثنين إلى ثلاثة سنتيمترات من الخرطوم بكل ثقب من فتحات الجهاز باستخدام مادة لاصقة سائلة للتجفيف الفوري. املأ القنوات بالماء المقطر باستخدام حقنة. اغمر الجهاز في حمام بالموجات فوق الصوتية لمدة 10 دقائق.
ثم أفرغ الماء داخل قنوات الجهاز واستخدم حقنة لإدخال محلول BSA بنسبة 5٪. تحضير تعليق للجسيمات الدقيقة الحديدية التي يبلغ قطرها 7.5 ميكرومتر في 5٪ BSA. احتضان الرقاقة وتعليق الجسيمات الدقيقة بمحلول الحجب لمدة ساعة على الأقل في درجة حرارة الغرفة.
بعد ذلك ، أدخل الجسيمات الدقيقة في الشريحة بإبرة حقنة من خلال خرطوم مخرج القناة الجانبية. ضع الشريحة عموديا ، ثم قم بتدوير الشريحة في خطوتين بزاوية 90 درجة بحيث تستهدف الجسيمات الدقيقة وتضغط عند تقييد الخمسة ميكرومتر. ختم جميع خراطيم جهاز الاكريليك بالحرارة.
اقطع خرطوم المدخل حتى يتبقى بضعة ملليمترات فقط. املأ إبرة التوزيع بمخزن الغسيل وأدخله في خرطوم القطع. اسمح للمحلول بالتنقيط ثم قم بتوصيل الإبرة بالجهاز.
اقطع خرطوم المخرج من القناة الجانبية ، ثم قم بتوصيله بمضخة المحقنة. بعد ذلك ، كرر نفس الإجراء لخرطوم مخرج القناة الرئيسية. ثم نعلق رقاقة إلى المغناطيس.
للكشف المناعي ، حافظ على تدفق مخزن الغسيل لمدة 10 دقائق بمعدل 50 ميكرولتر في الساعة. قم بإزالة المخزن المؤقت المتبقي للغسيل من إبرة التوزيع باستخدام ماصة دقيقة وأضف 50 ميكرولترا من معلق الجسيمات النانوية. تدفق تعليق الجسيمات النانوية لمدة سبع دقائق بمعدل تدفق 100 ميكرولتر في الساعة.
ثم قم بتغيير معدل التدفق إلى 50 ميكرولتر في الساعة واستمر في التدفق لمدة 15 دقيقة أخرى. قم بتغيير إبرة التوزيع وتدفق المخزن المؤقت للغسيل لمدة 10 دقائق بنفس المعدل. قم بإزالة المخزن المؤقت المتبقي للغسيل من إبرة الاستغناء باستخدام ماصة دقيقة وأضف 100 ميكرولتر من الركيزة الفلوروجينية.
اضبط معدل التدفق ومعلمات الوقت لإدخال الركيزة وقياس التألق وخطوة الغسيل. قم بتنشيط تدفق المدخلات للركيزة الفلوروجينية لمدة ست دقائق بمعدل 50 ميكرولتر في الساعة. قبل 15 ثانية من توقف تدفق الركيزة ، قم بتشغيل مضان المجهر.
ابدأ التقاط الصور باستخدام برنامج كاميرا المجهر قبل 10 ثوان من توقف الركيزة بوقت تعرض يبلغ 1،000 مللي ثانية. انقر فوق الزر "ابدأ" لمعلمة معدل التدفق المطلوبة فور توقف غسل الركيزة. قم بإجراء التصوير لمدة ست دقائق بمعدل إطار واحد في الثانية.
انقر فوق الزر "ابدأ" الخاص بتدفق الغسيل فور توقف تدفق القياس المحدد. تم استخدام الجسيمات النانوية المترافقة بالليزوزيم والجسم المضاد الثانوي المترافق لفجل الفجل الحصان للمقايسة المناعية. لوحظت زيادة في شدة التألق لتركيزات مختلفة من الأجسام المضادة الأولية مقارنة المناطق قبل وبعد المصيدة ، مما يدل على أن التغير في مضان الركيزة يتناسب طرديا مع تركيز الجسم المضاد الأولي.
بالنسبة لتركيز معين من الجسم المضاد الأولي ، تم رسم شدة التألق كدالة للوقت بمعدلات تدفق مختلفة للركيزة الفلورية. كانت قدرة تحويل الركيزة بواسطة إنزيم HRP تتناسب عكسيا مع معدل التدفق ، وتم الحصول على أقصى كثافة لمعدل تدفق واحد ميكرولتر في الساعة. بالنسبة لمعدلات التدفق المختلفة لتركيزات الأجسام المضادة الأولية المختلفة ، أظهرت منحنيات اختلافات التألق بعد وقبل التفاعل المناعي أنه بالنسبة لتركيز 1،000 نانوجرام لكل مليلتر ، فإن التألق يشبع لجميع معدلات التدفق التي تم تقييمها.
تم تحضير منحنى معايرة باستخدام القيمة القصوى للاختلافات في شدة التألق التي تم الحصول عليها فيما يتعلق بتركيز الجسم المضاد الأولي لكل معدل تدفق. يشير التباين العالي ومستويات التألق العالية عند ميكرولتر واحد في الساعة إلى أن المعدل لا يفضل تدفق الركيزة المتفاعلة ويميل إلى التراكم بعد المصيدة مباشرة. يجب إيلاء اهتمام خاص لخطوات ختم القنوات الدقيقة لأن التعرض للكلوروفورم حساس جدا لدرجة الحرارة.
للحصول على نتائج قابلة للتكرار ، يجب أن تكون درجة الحرارة هي نفسها دائما. يساعد نظامنا على فهم أين يكون انضغاط وحجم الجسيمات الدقيقة وحجم الجسيمات النانوية والمستضدات والأجسام المضادة للكشف والركيزة عوامل محددة لحد الكشف في المقايسة المناعية الموائع الدقيقة القائمة على الجسيمات النانوية.
