يوسع هذا البروتوكول فحص جرح الخدش الشائع جدا المستخدم في دراسات التجديد مع الطبقات الأحادية المشتقة من الأمعاء التي تمثل جميع أنواع الخلايا الرئيسية في الأمعاء الدقيقة. تتيح هذه التقنية التصور في الوقت الفعلي لإغلاق الجرح في نموذج أحادي الطبقة المعوية 2D الخدج لتجديد الأمعاء. يمكن تطبيق تقنيتنا على دراسة أمعاء الثدييات قبل الأوان ، والتي عادة ما تكون سيئة النمذجة باستخدام خطوط خلايا سرطان القولون والمستقيم المتحولة.
ابدأ بإذابة 96 ميكرولتر من المصفوفة خارج الخلية ، أو هيدروجيل BME القائم على ECM ، بين عشية وضحاها على الجليد عند درجتين إلى ثماني درجات مئوية. قم بتخفيف الهيدروجيل القائم على ECM و PBS البارد بدون كالسيوم أو مغنيسيوم بنسبة واحد إلى 50. قم بتغطية كل بئر من صفيحة زراعة الأنسجة المكونة من 24 بئرا ب 200 ميكرولتر من الهيدروجيل القائم على ECM المخفف بالجليد البارد واحتضن اللوحة المطلية لمدة ساعة واحدة على الأقل عند 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون.
ثم استنشق الوسائط من لوحة الثقافة المكونة من 24 بئرا تحتوي على المعوية ثلاثية الأبعاد الموجهة إلى الطبقات الأحادية واستبدلها ب 500 ميكرولتر من كاشف تفكك الخلايا لكل بئر. قم بتعطيل قباب الهيدروجيل القائمة على ECM يدويا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل من ثماني إلى 12 مرة ونقل محتويات 12 بئرا إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر. اغسل الآبار الفارغة ال 12 ب 250 ميكرولتر من كاشف تفكك الخلايا لضمان إزالة جميع الأمعاء ونقل المحتويات إلى أنابيب مخروطية سعة 15 ملليلتر.
الطرد المركزي للأنابيب المخروطية في 300g لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية والتخلص من supernatant. أضف 10 ملليلتر من المخزن المؤقت للغسيل DMEM / F-12 البارد إلى الأنابيب المخروطية الكريات المعوية عن طريق عكس الأنابيب. جهاز طرد مركزي على ارتفاع 300 جرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية وإزالة السوبرناتانت.
أعد تعليق كريات الخلايا في 12 ملليلتر من 37 درجة مئوية Trypsin-EDTA ووضع الأنابيب في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق أو حتى تبدو الخلايا قابلة للذوبان. أضف ثلاثة ملليلترات من مخزن الغسيل DMEM/F-12 العازل إلى كل أنبوب لتخفيف التربسين-EDTA. اخلطي عن طريق قلب الأنابيب وضعيها على الثلج.
قم بتصفية الأمعاء المنفصلة من خلال مصفاة خلية شبكية 37 ميكرومتر. اجمع المحتويات في أنابيب مخروطية نظيفة سعة 15 ملليلتر وقم بطرد الأنابيب مركزيا عند 300 جرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. قم بإزالة supernatant من الأنابيب المخروطية وأعد تعليق كريات الخلايا بستة ملليلترات من HOMGY.
بعد ذلك ، قم بإزالة اللوحة المطلية بالهيدروجيل القائم على ECM من الحاضنة وقم بشفط أي محلول هيدروجيل زائد قائم على ECM دون خدش السطح المطلي أو تجفيف اللوحة بالكامل. أضف 500 ميكرولتر من تعليق خلية HOMGY المدمج الذي يبلغ حجمه 12 ملليلتر في كل بئر من صفيحة 24 بئرا المطلية بهيدروجيل قائم على ECM. قم بتدوير اللوحة مع الغطاء لضمان توزيع متساو للخلايا داخل الآبار.
احتضن الصفيحة عند 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون ، وتبادل وسائط HOMGY كل يومين حتى تصل الطبقات الأحادية إلى أكبر من 90٪ من الالتقاء. بمجرد أن تصل الطبقات الأحادية إلى أكبر من 90٪ من الالتقاء ، قم بشفط الوسائط لإزالة أي خلايا تفشل في الالتصاق. عالج الخلايا ب 500 ميكرولتر من HA35 أو PBS الذائبة في HOMGY لمدة 24 ساعة.
بعد ذلك ، قم بإزالة الوسائط دون تعطيل سطح الطبقة الأحادية. باستخدام طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر ، قم بعمل خدش خطي عبر قطر السطح الكامل للطبقة الأحادية في كل بئر ، مع الحرص على عدم ترك الطبقات الأحادية تجف. اغسل الطبقات الأحادية المخدوشة مرة واحدة باستخدام 500 ميكرولتر من 1X PBS وأضف 500 ميكرولتر من HA35 أو PBS المذاب في HOMGY.
انقل الصفيحة إلى أداة تحليل الخلايا الحية داخل حاضنة 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون. ضمن أيقونة الجدول الزمني في برنامج تحليل الخلايا الحية ، انقر فوق أيقونة تشغيل إضافة معالج سفينة جديدة. حدد المسح الضوئي في الموعد المحدد، ثم انقر على التالي.
حدد جديد ضمن إنشاء سفينة وانقر فوق التالي ، ثم حدد بئر كامل ضمن نوع المسح الضوئي وانقر فوق التالي. اختر المرحلة لقنوات الصور و 4x للهدف. حدد الشركة المصنعة للوحة ورقم الكتالوج من القائمة المتوفرة وانقر فوق التالي.
حدد موقع سفينة فارغة متبوعا بنمط المسح الضوئي المطلوب. أدخل اسم اللوحة في الاسم، ثم حدد علامة الجمع لإنشاء تخطيط لوحة. حدد علامة الجمع الصغيرة لإنشاء اسم علاج.
أدخل الاسم المختصر ثم موافق. قم بتمييز آبار اللوحة المقابلة لتلك المعالجة وضرب زائد كبير لتعيين الآبار مع تلك المعاملة. أدخل التركيز المركب وانقر فوق موافق. عند اكتمال اللوحة، حدد موافق، التالي. حدد تأجيل التحليل إلى وقت لاحق متبوعا بإنشاء جدول زمني جديد مع عمليات المسح الضوئي على فترات زمنية مدتها أربع ساعات.
توقف عن المسح الضوئي في يوم واحد ، ساعة صفر. تأكد من صحة الملخص ثم أضفه إلى الجدول الزمني. في برنامج تحليل الخلايا الحية، حدد عرض في أعلى الشاشة.
من قائمة اسم السفينة، انتقل إلى الفحص المكتمل على مدار 24 ساعة وانقر نقرا مزدوجا فوق اسم السفينة. حدد أيقونة تصدير الصور والأفلام على اليسار متبوعة بالخيار كما هو معروض. قم بتمييز الآبار المثيرة للاهتمام، ثم حدد النقاط الزمنية المثيرة للاهتمام وسلسلة الصور كما هي معروضة.
تأكد من صحة نوع التسلسل وعمليات الفحص. حدد موقع المجلد المستهدف المطلوب. اختر JPEG من القائمة المنسدلة ثم تصدير.
افتح برنامج ImageJ وقم بتحميل صورة فحص جرح الخدش. حدد صورة، ثم اكتب 8 بت لتغيير الصورة من RGB 24 بت. حدد المكونات الإضافية أو وحدات الماكرو أو التثبيت Wound_healing_size المكون الإضافي لتثبيت المكون الإضافي لحجم التئام الجروح.
بعد ذلك ، اضبط نصف قطر نافذة التباين على 20 ، وقيمة العتبة على 100 ، والنسبة المئوية للبكسل المشبعة على 0.001. نعم لتعيين مقياس عالمي ثم انقر فوق موافق. تحقق من أن المنطقة المحددة هي منطقة الجرح وكرر ذلك للحصول على خدوش إضافية. أخيرا ، احسب النسبة المئوية لمنطقة التئام الجروح في منطقة الخدش للخلايا المهاجرة أو التكاثرية على مدار 24 ساعة باستخدام المعادلة الموضحة على الشاشة.
هنا ، T0 هي المنطقة في الوقت صفر ساعة ، و TC هي المنطقة في ساعات الصفر أو أربع ساعات أو 12 ساعة أو 24 ساعة. يتم عرض التوليد المعوي وإجراء فحص التئام الجروح أحادي الطبقة المشتق من الأمعاء في هذه الصور. يتم استخدام ثقافة الأمعاء الرئيسية ثلاثية الأبعاد وغير البشرية للانفصال إلى طبقات أحادية ثنائية الأبعاد.
نمت الطبقات الأحادية إلى أكثر من 90٪ من الالتقاء في صفيحة من 24 بئرا ثم عولجت باستخدام HA35 أو PBS لمدة 24 ساعة. ثم تم خدش الطبقات الأحادية بطرف ماصة P200. تظهر هنا الصور التمثيلية ل HA35 في علاجات التحكم في الطبقات الأحادية المعوية للرئيسيات غير البشرية.
تم الحصول على الصور في ساعات الصفر وأربع ساعات و 12 ساعة و 24 ساعة بعد إجراء خدش بطرف ماصة P200. يظهر تأثير HA35 على التئام الجروح والطبقات الأحادية هنا. يعتمد التغيير في التئام الجروح بمرور الوقت في الطبقات الأحادية المعوية على تركيز علاج HA35.
زاد HA35 بشكل كبير من التئام الجروح بعد أربع ساعات و 12 ساعة بمعدل 100 ميكروغرام لكل ملليلتر و 200 ميكروغرام لكل ملليلتر مقارنة بالتحكم ، لكن معدلات الشفاء تقاربت بين العلاجات بمقدار 24 ساعة. أحد أهم الأشياء التي يجب تذكرها مع هذا الإجراء هو أن الطبقات الأحادية المعوية المعوية قصيرة الأجل. لذلك ، بمجرد أن تصبح 90٪ من الموائع ، يجب على المحققين أن يتطلعوا إلى استخدامها بسرعة.
أصبحت هذه التقنية نموذجنا المفضل للتجديد المعوي المبكر في المختبر ، خاصة إذا كنا مهتمين بإصابات ميكانيكية أكثر من التهابية.
