نحن نصف بروتوكولنا لعزل الخلايا الجذعية الوسيطة عن أنسجة الحبل السري البشري وطريقة قوية لتمييزها إلى سلالة العضلات الهيكلية. تسمح لنا هذه التقنية بعزل الخلايا الجذعية الوسيطة التي تمتلك قابلية عالية للحياة والحرارة ، مع تلوث ضئيل أو معدوم للخلايا ذات الأصل البطاني وتحفيز التمايز العضلي بكفاءة في هذه الأمراض. التواء الحبل والاتساق المخاطي يجعل من الصعب التعامل مع الحبل.
نوضح كيفية معالجة الحبل ، وعدم كشط هلام وارتون ، واستبعاد الخلايا البطانية من السكان. بعد جمع أنسجة الحبل السري في وقت التسليم ، انقل قطعة أنسجة الحبل السري من أنبوب التجميع إلى طبق معالج بزراعة الأنسجة بمساحة 10 سنتيمترات مربعة ، واغسل الأنسجة جيدا باستخدام PBS الطازج. للعناية بالتواء الحبل السري والسطح المخاطي ، قم بتثبيت الأنسجة بزوج من الملقط المثبتة في يد واحدة.
باستخدام مشرط ، قم بتقطيع أنسجة الحبل السري عموديا على طول وصولها الطولي للحصول على قطعتين نصف أسطوانيتين. عند هذه النقطة ، راقب الشرايين والأوردة السرية. باستخدام مشرط ، قم بإزالة الأوعية الدموية عن طريق كشطها في اتجاه واحد من السطح وشطف أنسجة الحبل السري في PBS لإزالة جميع الدم المتبقي المرتبط بالأنسجة.
افرم كل نصف من أنسجة الحبل السري إلى شظايا بحجم 0.5 سنتيمتر مكعب. ضع الشظايا مع السطح المضيء المواجه لأسفل على الطبق واحتضن الطبق لفترة وجيزة لمدة 10 دقائق. في نهاية الحضانة ، أضف 20 ملليلتر من الوسط الذي يحتوي على تعديل MEM Alpha بلطف على طول جانبي الطبق الذي يحتوي على أنسجة الحبل السري.
تأكد من عدم إزاحة النباتات من اتجاهها وإضافة وسط زائد لحساب جزء صغير سوف تمتصه النباتات أثناء الحضانة. ثم ضع الطبق في الحاضنة لمدة ثلاثة أيام. بعد انتهاء الحضانة ، أضف وسيطا طازجا إلى الثقافة وتأكد من حماية الثقافات من الصدمات وحركة النباتات أثناء التعامل مع الأطباق.
بعد أسبوع واحد ، باستخدام ملقط معقم ، قم بإزالة شظايا الأنسجة بشكل فردي وتخلص منها باستخدام أكياس المخاطر البيولوجية المناسبة للتخلص منها. احتفظ بالوسط الموجود وأضف 10 ملليلتر من وسط النمو الطازج. استبدل وسط النمو كل أربعة أيام حتى تصل المستعمرات الفردية إلى التقاء 70٪ بعد تلطيخ الخلايا كما هو موضح في المخطوطة ، قم بتحليل الخلايا المصنفة بواسطة قياس التدفق الخلوي ، وحدد النسبة المئوية للخلايا الإيجابية CD105 CD90 ، والخلايا الإيجابية CD105 CD73.
تحليل الخلايا السالبة CD105 وCD34 CD45 بشكل منفصل. قم بتغطية لوحة زراعة الأنسجة ب 0.01٪ كولاجين و 20 ميكروغرام لكل ملليلتر من اللامينين في PBS وضعها على الروك لمدة لا تقل عن أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، قم بإزالة الكولاجين واغسل اللوحة باستخدام PBS ، ثم قم بلوحة uMSCs عند 10،000 خلية لكل سنتيمتر مربع في وسط النمو.
بمجرد أن تصل الخلايا إلى التقاء بنسبة 70٪ ، قم بشفط وسط النمو ، وشطف لوحة الثقافة مرتين باستخدام PBS. لتحديد حركية التقدم العضلي ، أضف وسط M1 كل يومين إلى الثقافات وقم بتحليل uMSCs للتعبير عن pax7 و MyoD و myogenin و myosin سلسلة ثقيلة في يومين ، من أربعة إلى خمسة أيام ، من ستة إلى سبعة أيام ، وعشرة إلى أربعة عشر يوما على التوالي. تعرض uMSCs تعبير CD105 وCD90 ولا تعبر عن علامات المكونة للدم CD34 وCD45.
كانت uMSCs إيجابية أيضا للتعبير عن علامة uMSCs CD73 ، مما يشير إلى أن uMSCs عبرت عن علامات رئيسية متعددة. أظهرت uMSCs تعبيرا عن pax7 خلال اليومين الأولين من إضافة M1 ، متبوعا بتعبير MyoD خلال الأيام الأربعة الأولى من إضافة M1. تعبر الخلايا عن بروتين الميوجينين في ستة أيام من التمايز ، تليها التعبير عن سلسلة الميوسين الثقيلة بين 10 أيام و 14 يوما من تحريض التمايز.
تم تنظيم 970 جينا استجابة لتحريض التمايز العضلي المنشأ مقارنة ب uMSCs غير المتمايزة. تم تنظيم المزيد من الجينات العضلية في uMSCs المشتقة من أنسجة الحبل السري مقارنة ب uMSCs المشتقة من دم الحبل السري. ظهر كل من أنسجة الحبل السري ودم الحبل السري تنظيم الجينات المتعلقة بالبروتينات الهيكلية الخلوية ، المرتبطة بربط الأكتين وتجميع الساركومير ، والناقلات المرتبطة بوظيفة الانقباض ، وصيانة كتلة العضلات ، وإشارات الكالسيوم ، والوظيفة الأنزيمية.
جمع الأنسجة تحت حالة معقمة والحفاظ على ثقافة معقمة. يجب أن يكتسح الحبل خارجيا بنسبة 70٪ من الإيثانول ومعالجته في أسرع وقت ممكن. تتطلب العديد من العلاجات التجديدية أعدادا كبيرة من الخلايا من الممرات المبكرة.
ويمكن أيضا أن تستخدم كنموذج لتقليد البيئة الجافة بأكملها وتعكس التمثيل الغذائي بعد الولادة.
