تصف هذه الطريقة تقنية لدراسة إعادة تشكيل الغشاء أثناء هجرة العدلات في الحي باستخدام الفحص المجهري تحت الخلوي داخل الجسم. يوفر هذا البروتوكول نهجا فريدا لدراسة ديناميكيات الغشاء أثناء هجرة في ظل الظروف المادية ، وإلغاء إشراك البيئة المكروية للأنسجة. يمكن تصميم هذه التقنية لمعالجة إعادة تشكيل الغشاء وإعادة وضع الأعضاء الديناميكية للهيكل الخلوي والاتجار بالغشاء في أنواع مختلفة من الخلايا والخلايا المهاجرة.
للبدء ، أضف صبغة الفلورسنت الخضراء إلى تعليق العدلات ، المنقى من الفأر البري في 1.5 ملليلتر من الأنبوب المطلي BSA. احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة تحت التحريض لطيف في أنبوب الدوار. أعط ثلاث غسلات باستخدام HBSS ، متبوعا بالطرد المركزي عند 400 مرة G في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق ، وإعادة تعليق الحبيبات في محلول ملح هانكس المتوازن واحد ملليلتر.
ضع هذا التعليق في الأنبوب المطلي ب BSA في دوار أنبوبي تحت تحريض لطيف حتى إجراء الحقن. قبل الحقن ، أعد تعليق حبيبات الخلية في محلول ملحي للوصول إلى كثافة تتراوح من 2 مليون إلى 5 ملايين خلية لكل 20 ميكرولتر. نقل المخدر إلى وسادة تدفئة بها 37 درجة مئوية للحفاظ على درجة حرارة جسمه.
بعد اختبار منعكس انسحاب المخلب ، قم بإزالة الشعر من الأذن باستخدام أداة تشذيب دقيقة لتحسين جودة الصورة. ضع على جانبه ، وأمسك حافة الأذن ، وقم بتسويته على طول وسادة الاحترار باستخدام الشريط الجراحي ، ثم املأ حقنة مجهزة بإبرة قياس 33 مع تعليق العدلات وقم بتثبيته على جهاز micromanipulator. حرك الإبرة برفق نحو الأذن ، واخترق الجلد ببطء.
بمجرد أن تصبح الإبرة داخل الجلد ، ادفع المكبس ببطء ، وقم بتوصيل 2 إلى 3 ميكرولتر من تعليق الخلية. بعد تكرار الحقن بعناية لمنطقتين إلى ثلاث مناطق مختلفة من الأذن ، قم بإزالة الشريط الجراحي بعناية ، ودع يستعيد وعيه تحت الإشراف. اترك يستريح لمدة ساعة واحدة قبل التصوير للسماح للأنسجة والخلايا بالتعافي من إجراء الحقن.
تأكد من تشغيل المجهر ، وتسخين المسرح والعدسات مسبقا إلى 37 درجة مئوية قبل وضع المخدر على مرحلة المجهر. قم بتغطية الفتحة الموجودة في المسرح بغطاء زجاجي. انقل المخدر إلى المسرح بعناية.
إذا تم التخطيط للتصوير لأكثر من ساعة ، فقم بتطبيق مرهم العيون ، وقم بتأمين نظام التروية المجنح القائم على التسريب. ضع قطرة من المحلول الملحي في وسط غطاء الغطاء ، وضع الأذن المحقونة بالعدلات فوقها. قم بتسطيح الأذن برفق باستخدام قطعة قطن معقمة عبر منتصف غطاء الغطاء لإزالة الجيوب الهوائية.
قم بتأمين الأذن عن طريق الضغط برفق على عصا خشبية على جانب الأذن بالقرب من رأس ، وقفلها باستخدام شريط لاصق. ثم ابحث عن منطقة اهتمام باستخدام عدسة المجهر ، وانتقل إلى وضع اكتساب الفوتون المتعدد. اضبط الطول الموجي للإثارة بالليزر على 900 إلى 930 نانومتر للسماح بالاستحواذ المتزامن على صبغة الفلورسنت الخضراء والطماطم mTomato و Collagen-I.
ثم اضبط المجموعة المناسبة من المرايا ومجموعات المرشحات على أجهزة الكشف لجمع الضوء المنبعث. تحديد الإعداد الأنسب لتكوين الأجهزة. حتى إذا كان من الممكن تتبع الخلايا المهاجرة بفواصل زمنية تتراوح من 30 ثانية إلى دقيقة واحدة ، فقم بتصوير الأحداث تحت الخلوية بسرعة أعلى لا تقل عن عشر ثوان.
في نهج الفحص المجهري الكلاسيكي داخل الجسم ، استخدم عدسة 30X وماسح ضوئي Galvo بحجم صورة 512 × 512 بكسل لتتبع هجرة الخلية والتحقيق في أنسجة الماوس المضيف ، وتعيين إزاحة المحور Z باستخدام المرحلة الآلية بحجم خطوة يبلغ 2 ميكرومتر للسماح بتصوير حجم عميق 30 ميكرومتر كل 30 ثانية. في نهج الفحص المجهري تحت الخلوي داخل الجسم ، استخدم عدسة 40X وماسح ضوئي بالرنين بمتوسط ثلاث مرات لتصوير إعادة تشكيل الغشاء الديناميكي للغاية بتكبير ودقة أعلى. قم أيضا بتعيين إزاحة المحور Z باستخدام بيزو بحجم خطوة يبلغ ميكرومتر واحد ، مما يسمح بتصوير حجم عميق يبلغ 20 ميكرومتر كل أربع إلى خمس ثوان.
حث إصابة ليزر معقمة لتحفيز هجرة العدلات عن طريق تركيز ليزر إثارة عالي الطاقة على مساحة ضيقة تبلغ 20 × 20 ميكرومتر لمدة 10 ثوان. تحديد الإصابة الناجمة عن الليزر من خلال إشارات الفلورسنت الذاتي القوية التي تظهر في جميع القنوات ، ومن خلال التغيير الناتج في ترتيب الكولاجين. احفظ البيانات في نهاية التجربة لمزيد من التحليلات.
مكن الماوس المتلقي من تصور السمات الهيكلية في أنسجة الأذن مثل الأوعية الدموية والخلايا المقيمة وبصيلات الشعر عبر نهج قائم على الفحص المجهري داخل الجسم. تم تصور الإصابات المستحثة بالليزر بسهولة بسبب تألقها الذاتي القوي المكتشف في جميع القنوات ، ومن خلال تعديلات ترتيب الكولاجين. تصور رؤية كاملة للبنية ثلاثية الأبعاد للجلد وتوطين العدلات المحقونة كومة Z من الجلد من الطبقات الخارجية إلى الطبقات الداخلية في عرض حجم ثلاثي الأبعاد.
أظهر التصوير بفاصل زمني أن العدلات تأخذ عينات من جلد الأذن وتتفاعل مع المصفوفة داخل الخلايا والأنسجة المضيفة. باستخدام المجهر تحت الخلوي داخل الجسم ، يتم تصور إعادة التشكيل الديناميكي لغشاء البلازما أثناء الهجرة ، وتشكيل نتوءات الغشاء عند الحافة الأمامية ، وتراجع الجزء الخلفي من الخلايا. تكشف تسلسلات الفاصل الزمني عن تعقيد التفاعلات مع المصفوفة داخل الخلايا.
تم تحليل الديناميكيات المحلية لغشاء البلازما باستخدام خط أنابيب خوارزمية يعتمد على تحديد 100 نقطة حدودية تحت سطح الخلية. تم حساب التغيرات في الانحناء المحلي والمنطقة التي تحتها نتوءات غشاء البلازما لكل نقطة حدودية ، وتم الإبلاغ عنها لكل إطار زمني كأجهزة قياس كيوموجراف. يحافظ كل من الجزء الأمامي والخلفي من الخلايا على انحناء أعلى من جانب الخلايا.
تكون تغيرات المنطقة السلبية أكثر وضوحا في الجزء الخلفي من الخلايا منها في الحافة الأمامية ، حيث تكون تغييرات المنطقة الإيجابية أكثر بروزا. بعد التصوير ، يمكن جمع الأنسجة وتثبيتها ومعالجتها للتلطيخ لمزيد من التقييم المستهدف للاهتمام وتوضيح الآليات. يمكن تصميم هذا الإجراء المصمم لتصوير ديناميكيات الغشاء لمعالجة مسألة بيولوجيا الخلية الأوسع نطاقا في أنواع الخلايا المختلفة والخلايا المهاجرة في بيئاتها الخاصة.
