باستخدام هذه الأداة المتطورة وغير الغازية ، يمكننا مراقبة حركية نمو الورم في الوقت الفعلي والاستعمار النقيلي في الفئران ، والتي لديها إمكانات كبيرة في علاج سرطان الثدي وإدارة الأمراض. يعد الجمع بين لوسيفيراز والكشف عن التألق استراتيجية مفيدة لتعزيز الدراسات قبل السريرية لتطور سرطان الثدي وإدارة المرض. يمكن تطبيق ذلك على دراسات الأدوية المضادة للسرطان.
لا يقتصر هذا البروتوكول على سرطان الثدي ويمكن تطبيقه على سرطانات أخرى ، مثل الرئة والبنكرياس. ابدأ بزراعة الخلايا MCF-7 و MDA-MB-468 و MDA-MB-231 GFP و luciferase الإيجابية بشكل منفصل في صفيحة طولها 16 سم إلى 80٪ من التقاء. بعد حصاد الخلايا عن طريق التربسينات ، قم بزرع عدد متزايد من الخلايا في كل بئر في صفيحة سوداء من 96 بئرا.
ثم ، املأ جميع الآبار ب 100 ميكرولتر من DMEM ، واحتضنها لمدة 16 إلى 24 ساعة في 37 درجة مئوية ، حاضنة 5٪ CO2. تحضير محلول لوسيفيرين في PBS بتركيز 1.5 ملليغرام لكل ملليلتر ، وتخزين المحلول عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. بعد الحضانة ، اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS بلطف قبل إضافة 100 ميكرولتر من محلول luciferin في كل بئر.
انتظري لمدة دقيقتين، ثم قم بقياس نشاط لوسيفيراز في جميع خلايا سرطان الثدي باستخدام التلألؤ الحيوي. قبل حقن الفأر ، قم بنقل خمسة ملايين خلية MCF-7 و MDA-MB-468 إلى 200 ميكرولتر من PBS ومليوني خلية MDA-MB-231 GFP و luciferase إيجابية إلى 100 ميكرولتر PBS. تحضير الماوس المخدر للحقن عن طريق وضع مخروط فوق الرأس في وضع ضعيف.
بعد ذلك ، امسح منطقة البطن من الماوس فوق الغدة الثديية بالإيثانول باستخدام قطعة قطن ، وارفع الغدة الثديية الرابعة بالملقط قبل إدخال إبرة قياس 27 تحت وسادة الدهون لحقن 100 ميكرولتر ببطء من تعليق الخلية المعدة. بعد الحقن ، أخرج الفأر من الغطاء وانقله إلى قفص جديد تحت الملاحظة حتى يعود إلى الوعي. قبل الكشف عن التلألؤ الحيوي ، قم بتقييد الماوس الواعي عن طريق تثبيت رقبته باليد اليسرى وإمالة اليد إلى اليسار ، مما يؤدي إلى وجه الماوس لأعلى مع الجزء السفلي من الجسم في وضع ضعيف.
حقن 100 ميكرولتر من لوسيفيرين 30 ملليغرام لكل ملليلتر داخل الصفاق في الربع البطني الأيسر السفلي من الماوس باستخدام حقنة ملليلتر واحد. احتفظ بالفأر لمدة سبع دقائق دون تخدير، تليها ثلاث دقائق داخل غرفة التخدير قبل قياس حركية الورم. أثناء وجود الماوس قيد الحضانة، افتح البرنامج وقم بتهيئة نظام التصوير بالنقر فوق الزر تهيئة.
حافظ على الإعداد في التعريض الضوئي التلقائي مع وقت التعريض الضوئي في الوضع التلقائي عند 60 ثانية، ووسط الربط عند فتحة f/stop one، ومرشح الإثارة المحظور، وفلتر الانبعاثات مفتوحا. عند انتهاء التهيئة، حدد معالج التصوير والتلألؤ الحيوي ثم انقر فوق التالي، فتح عامل التصفية لتحديد الماوس في موضوع الصورة. في طريقة عرض الحقل، حدد المرحلة C عند 10 سنتيمترات وارتفاع الهدف عند 1.50 سم.
ثم انقر فوق مرحلة إعداد الصورة إلى C.تأكد من وضع الماوس على المسرح في وضع الاستلقاء المناسب قبل إغلاق الباب والنقر فوق الزر "اكتساب". انتظر حتى تظهر صورة على الشاشة. كرر الإجراء الخاص بالماوس الآخر.
للكشف عن ورم خبيث في الرئة، قم بتغطية الإشارة القوية للورم الأساسي باستخدام ورق مقوى سميك وقم بفضح الجانب البطني من الرئتين فقط نحو الكاميرا. التقط الصورة باستخدام نفس المعلمات الموضحة سابقا. أصيبت خطوط خلايا سرطان الثدي بناقل فيروس lentivirus يعبر عن GFP الفلورسنت ويخضع لفرز FAC.
تم فرز الخلايا الإيجابية GFP بعد يومين من العدوى ، مطلية وتصور بواسطة المجهر الفلوري. تم تأكيد نشاط لوسيفيراز في المختبر مع زيادة تعتمد على عدد الخلايا في مستويات نشاط لوسيفيراز. بالإضافة إلى ذلك ، تم العثور على علاقة خطية بين نشاط luciferase ورقم الخلية.
بعد حقن خطوط خلايا سرطان الثدي ، خضعت الفئران لقراءة التلألؤ الحيوي كل أسبوعين لتحديد حركية نمو الورم. كانت حركية نمو الورم أسرع في خطوط خلايا MDA-MB-231 مقارنة بخطوط الخلايا الأقل عدوانية ، MCF-7 و MDA-MB-468. تم تحديد نشاط التلألؤ كميا لثلاثة خطوط خلوية.
بعد ستة أسابيع من الحقن ، تم العثور على الأورام التي تم حصادها للحفاظ على تعبير GFP. أيضا ، تم الحصول على قراءات التلألؤ الحيوي الإيجابية من رئة الفأر بأكمله في الوقت الفعلي. تم حصاد الرئة للتحقق من المستعمرات النقيلية الإيجابية ، ولوحظت المستعمرات النقيلية ل GFP والتلألؤ الحيوي.
من المهم أن تكون حذرا أثناء إجراء عملية الحقن. قد يؤدي الحقن غير السليم إلى انحراف في معدل نمو الورم أو عدم وجود ورم. يمكننا فحص ورم خبيث في الرئة في الجسم الحي وخارج الجسم الحي عن طريق الكشف عن تعبير GFP.
بالإضافة إلى ذلك ، يمكننا أيضا دراسة علم الأمراض النسيجية للرئتين عن طريق التلطيخ القائم على الكيمياء النسيجية المناعية. يمكن أن تكون هذه التقنية مفيدة لاستكشاف الأسئلة الجديدة ، مثل تأثير دراسات فعالية الدواء.
