إنتاج الجسيمات النانوية الدهنية المحملة بالحمض النووي الريبوزي المرسال (siRNA) باستخدام جهاز الموائع الدقيقة

يؤثر حجم الجسيمات النانوية الدهنية على التوزيع الحيوي ، والتأثير المضاد للورم ، وأداء إسكات الجينات. لذلك ، فإن طريقة التحكم في حجم LNP هي تقنية فعالة لإنتاج أدوية النانو ، بما في ذلك أنظمة توصيل الحمض النووي الريبي. كان هذا الجهاز الموائع الدقيقة الأصلي ، المسمى جهاز iLiNP ، قادرا على التحكم في حجم LNP الذي يتراوح من 20 إلى 100 نانومتر على فترات 10 نانومتر.

يمكن لجهاز iLiNP إنتاج ليس فقط LNPs المحملة ب siRNA ، ولكن أيضا جميع LNPS المحملة بالحمض النووي الريبي ، و LNPs المحملة بالبروتين الريبي. للبدء ، خذ محاليل الإيثانول الدهنية وأنتج LNPs المحملة ب siRNA عن طريق خلط حلول DOTAP و DSPC و cholesterol و DMG-PEG2k بنسبة مولية من 50 إلى 10 إلى 38.5 إلى 1.5. اضبط تركيز الدهون الكلي على ثمانية ملليمول.

ثم خذ المحاليل المائية من 154 مللي مولا ملحي و 25 ملليمولار خلات عازلة عند الرقم الهيدروجيني 4 وقم بتصفيتها من خلال مرشحات غشاء 0.2 ميكرومتر أو مرشحات محاقن. قم بتحضير محلول siRNA المخزن المؤقت عن طريق إذابة 70 ميكروغرام من siGL4 في ملليلتر واحد من المخزن المؤقت لخلات 25 ملليمولار. املأ محاقن زجاجية واحدة بملليلتر بمحاليل دهنية ومائية ، على التوالي.

قم بتوصيل المحاقن الزجاجية بالشعيرات الدموية القصوى باستخدام موصلات المحاقن ، ثم اضبط معدل تدفق المحاليل الدهنية والمائية وأدخل المحاليل الدهنية والمائية بشكل منفصل في جهاز iLiNP باستخدام مضخات المحاقن. اجمع معلقات LNP في أنبوب دقيق من مخرج جهاز iLiNP. قم بتحويل تعليق LNP باستخدام غشاء غسيل الكلى من 12 إلى 14 كيلودالتون قطع الوزن الجزيئي عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها ضد المالحة أو DPBS ل POPC LNPs و siRNA المحملة LNPs ، على التوالي.

اجمع معلقات LNP المشوهة في أنابيب دقيقة ثم قم بسحب 20 إلى 30 ميكرولتر من تعليق LNP إلى خلية كوارتز صغيرة. أخيرا ، قم بقياس حجم LNP وتوزيع حجم LNP ومؤشر تشتت poly عن طريق تشتت الضوء الديناميكي. يتم عرض توزيع حجم POPC LNP المنتج في ظروف تدفق مختلفة ، مثل معدل التدفق الكلي ونسب معدل التدفق هنا.

يمكن التحكم في أحجام LNP الدقيقة التي تتراوح من 20 إلى 100 نانومتر باستخدام جهاز iLiNP هذا. يتم تشكيل LNPs صغيرة الحجم في ظروف معدل التدفق الكلي العالية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن أحجام LNP التي يتم تشكيلها في FRR 5 أصغر من أحجام FRR 3 ، بغض النظر عن معدل التدفق الكلي.

يظهر توزيع حجم LNPs المحملة ب siRNA هنا. يتم تغليف siRNAs في LNPs عن طريق التفاعل الكهروستاتيكي بين DOTAP الدهون الكاتيونية و siRNAs سالبة الشحنة. أنتج جهاز iLiNP 90 نانومتر من LNPs الكاتيونية المحملة بالحمض النووي الريبوزي المرسال مع توزيع ضيق.

كانت كفاءة تغليف siRNA 95٪ بسبب التفاعل الكهروستاتيكي بين الدهون الكاتيونية و siRNAs سالبة الشحنة. تم تقييم السمية الخلوية ونشاط إسكات الجينات ل 19 نانومتر من الحمض النووي الريبي المحمل بالحمض النووي الريبوزي المرسال. أظهرت LNPs المحملة ب siRNA سمية خلوية بجرعة 10 إلى 100 نانومولار siRNA.

انخفض مستوى التعبير عن luciferase اعتمادا على تركيز siRNA. قامت LNPs المحملة ب siRNA بقمع تعبير لوسيفيراز بنسبة 80٪ بجرعة 100 نانومولار siRNA. تعد تحسينات ظروف التدفق أهم الخطوات في البروتوكول للحصول على LNPs ذات الحجم المطلوب.

لا تتطلب طريقة إنتاج LNP القائمة على الموائع الدقيقة بما في ذلك جهاز iLiNP أي إجراء معقد ومن المتوقع أن يتم استخدامها كطريقة إنتاج LNP القياسية.