يساعدك هذا البروتوكول على تحديد الطفرات التي تحدث أثناء إصلاح كسر مزدوج الخيط الناجم عن الحمض النووي الريبي أحادي التوجيه وCAS9. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها طريقة فعالة من حيث التكلفة وقوية للكشف عن الطفرات في موضع جينومي محدد. نحن نستخدم الخلايا الكيراتينية البشرية كمثال ، ولكن يمكن تكييف هذا البروتوكول مع أي خطوط خلوية قابلة للنقل.
سيوضح هذا البروتوكول تايلور بوغبي ، مساعد جامعي من مختبرنا. للبدء ، استزراع خلايا HFK LXSN و HFK 8E6 في ألواح 10 سنتيمترات عند 37 درجة مئوية مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون في حاضنة سترة تحتوي على وسائط زراعة الخلايا الكيراتينية مع ملحق نمو الخلايا الكيراتينية البشرية و 1٪ البنسلين ستربتومايسين. استبدل وسائط الاستزراع بثلاثة ملليلترات من التربسين-EDTA واحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق.
ثم، قم بتحييد التربسين بحجم متساو من الوسائط المكملة من قبل FBS. الآن ، انقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر وأجهزة طرد مركزي بسرعة 300 مرة G لمدة خمس دقائق. أعد تعليق الخلايا التي تحتوي على 10 ملليلتر من وسائط زراعة الخلايا الكيراتينية باستخدام مكمل نمو الخلايا الكيراتينية البشرية وحدد تركيز الخلايا باستخدام مقياس مفاصل.
بعد ذلك ، زرع لوحين لكل من خلايا HFK LXSN و HFK 8E6 في أربعة ملليلتر من وسائط زراعة الخلايا الكيراتينية مع ملحق نمو الخلايا الكيراتينية البشرية و 1٪ من البنسلين ستربتومايسين. بعد البذر ، احتضن الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون في حاضنة سترة. في يوم النقل ، استبدل الوسائط بثلاثة ملليلترات من الوسائط المكملة الخالية من المضادات الحيوية واحتضنها لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية في حاضنة سترة.
لنقل الخلايا ، قم بتسخين كواشف النقل إلى درجة حرارة الغرفة وماصة بلطف قبل الاستخدام. ضع كمية مناسبة من المخزن المؤقت للنقل في أنبوبين معقمين لأجهزة الطرد المركزي سعة 1.5 ملليلتر لكل خط خلية وقم بتسميتهما على أنهما أنبوب واحد ونقل وهمي أو أنبوب اثنين. ثم ، أضف ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد المعبر ، CAS9 ، دليل واحد ، CD4 البشري الذي يستهدف الحمض النووي الريبي إلى أنبوب واحد وماصة بلطف لخلط تماما.
أضف كمية متساوية من الماء المعقم إلى الأنبوب الثاني. أضف كمية مناسبة من كاشف النقل إلى أنبوب واحد مع خليط الحمض النووي والنقل الوهمي أو الأنبوب الثاني. باستخدام ماصة ، امزجها بلطف تماما واحتضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 إلى 30 دقيقة لتشكيل المجمعات.
يضاف خليط النقل إلى الطبق ويهز صفيحة الاستزراع برفق لمدة دقيقة واحدة لتوزيع خليط النقل بالتساوي. لحصاد الخلايا عن طريق التربسينات ، استبدل وسائط الثقافة بملليلتر واحد من التربسين EDTA واحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق. بعد ذلك، قم بتحييد التربسين بحجم متساو من الوسائط المكملة من قبل FBS.
لكل صفيحة من الخلايا ، انقل تعليق الخلية إلى أنبوبين من أجهزة الطرد المركزي الدقيقة مع أليكوتات متساوية وأجهزة طرد مركزي عند 300 مرة G لمدة خمس دقائق. بعد الطرد المركزي ، أعد تعليق حبيبة الخلية من أنبوب واحد في ملليلتر واحد من PBS للتسلسل ، وفي أنبوب آخر ، مع PBS بارد مثلج لبقع المناعة. تم إجراء فحص اللطخة المناعية لمقارنة تعبير CAS9 في خلايا HFK غير المنقولة والمنقولة.
أظهرت النتائج أن خلايا HFK غير المنقولة والمعبرة عبرت عن كمية مماثلة من CAS9 ، مما يشير إلى أن كفاءة النقل متشابهة بين خطين خلويين. تم الحصول على صور الفحص المجهري المناعي للهيستون المفسفرة H2AX S139 في الخلايا المنقولة SgRNA / CAS9 والتحكم غير المنقول. أشارت النتائج إلى أن اثنين من فواصل الخيوط المزدوجة تم تحفيزهما بواسطة CAS9 SgRNA.
تم تجميع الاختلافات الجينومية حسب أنواع الأحداث الطفرية في HFK LXSN و HFK 8E6 ، حيث تمت مقارنة كل مجموعة من الاختلافات الجينومية والعدد الإجمالي للاختلافات بين HFK LXSN و HFK 8E6. أظهرت النتائج أن 8E6 يزيد من الاختلافات الجينومية داخل 200 كيلو قاعدة حول فواصل الخيوط المزدوجة التي تسببها CAS9 ، مما يشير إلى أن فيروس الورم الحليمي البشري 8E6 يزيل تنظيم إصلاح كسر الخيط المزدوج ويزيد من عدم الاستقرار الجينومي. الغرض من اللطخة المناعية هو قياس كفاءة النقل ، والتي ينبغي مراعاتها أثناء تحليل البيانات.
بالإضافة إلى كفاءة النقل ، يمكن استخدام المجهر المناعي لتأكيد تحريض كسر الخيط المزدوج باستخدام phospho-H2AX كعلامة. نحن نستخدم بيتا فيروس الورم الحليمي البشري 8E6 كمثال. يمكن استخدام هذه التقنية للكشف عن التغيرات في تردد الطفرة أو نوعها الناجم عن كواشف أخرى مثل مثبطات الجزيئات الصغيرة.
