يستخدم هذا البروتوكول اثنين من المقايسات شبه الموتومة المختلفة لقياس النشاط الحركي C.elegans بسرعة في الوسط السائل ، ولديه القدرة على تطبيقه لفحص الأدوية في نماذج مرض C.elegans. المزايا الرئيسية لهذين التقنيتين هي سهولة استخدامها وسهولة استنساخها. كلا التقنيتين لديها القدرة على تقييم آثار المخدرات على سلوك دودة مع الإنتاجية المتغيرة.
هذه المقايسات الحركة مفيدة لتقييم النشاط الحركي لنماذج مرض الميتوكوندريا C.elegans التي يضعف فيها النظام العصبي العضلي للحيوانات. لتحليل النشاط الحركي C.elegans في الوسط السائل على الشرائح الزجاجية بعد مزامنة التحكم في سلالات الديدان المتحولة على لوحات NGM مع وبدون علاجات المخدرات التي تهم مرحلة L4 ، استخدم اختيار دودة ومنظار مجسم لاختيار خمس ديدان لكل سلالة وحالة في قطرات فردية 20 ميكرولتر من محلول S.basal على شريحة زجاجية. إضافة الديدان من نفس الحالة التجريبية من لوحات NGM مختلفة إلى قطرات متعددة على نفس الشريحة للحصول على تكرارات تقنية متعددة.
عندما يتم جمع جميع الديدان ، اسمح للحيوانات بالتأقلم على الشريحة لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة قبل تسجيل نشاط السباحة الديدان في كل قطرة لمدة دقيقة واحدة بمعدل 15 إطارا في الثانية لكل قطرة. لتحليل النشاط الحركي المسجل C.elegans باستخدام برنامج ZebraLab ، استخدم خيار ZEBRALAB AVI لتحميل مقاطع الفيديو إلى البرنامج. انقر فوق الخيار تحديد كمية مع ملفات AVI.
لإنشاء بروتوكول جديد، حدد المعلمات ومعلمات البروتوكول والوقت، ثم قم بتعيين مدة التجربة إلى دقيقة واحدة. حدد "لا سلة زمنية" ثم قم بإلغاء تحديد "فترة التكامل" وفقا لإخراج البيانات المطلوب وحدد ملف وفتح فيلم لتحميل كل ملف فيديو مسجل مسبقا. لبناء منطقة واحدة من الكشف، استخدم أداة الدائرة لإنشاء منطقة حول قطرة السائل بأكملها التي تقع فيها الديدان.
سيتم الكشف عن نشاط جميع الديدان داخل المنطقة المحددة. للإشارة إلى المسافة للمعايرة، ارسم خطا أفقيا من اليسار إلى يمين منطقة الفيديو وحدد معايرة ورسم وتطبيق على المجموعة. للسماح بالكشف عن كافة سلالات فيروس C.elegans المختلفة التي سيتم تحليلها، قم بإلغاء تحديد رمز المنطقة وضبط حساسية الكشف في عتبة النشاط.
لتصور المسارات التي صنعتها الحيوانات أثناء إجراء تحليل النشاط، قم بتعيين مقياس العرض إلى 70 وحدد تطبيق على المجموعة. لتحليل مقاطع الفيديو، انقر فوق تشغيل، وحدد التجربة، وتنفيذ لإدخال اسم ملف للفيديو. بعد الحفظ، ستظهر نافذة تسألك عما إذا كنت تريد تحليل الفيديو بأقصى سرعة للكمبيوتر.
انقر فوق نعم. سيتم فتح إطار التجربة قيد التشغيل. انقر فوق ابدأ.
عند اكتمال تحليل التسجيل، انقر فوق التجربة وتوقف لحفظ النشاط الذي تم تحليله في القطيرات في جدول بيانات. لتحليل النشاط الحركي C.elegans في الوسط السائل في شكل لوحة 96 جيدا، عندما وصلت الديدان إلى مرحلة L4، إضافة 50 ميكرولتر من وزن 2٪ لكل حجم من E.coli OP50 والمتوسطة S.basal إلى كل بئر من لوحة صغيرة صافية 96 جيدا أسفل شقة. استخدم المنظار المجسم لاختيار 15 دودة متزامنة يدويا لكل بئر من لوحة 96 بئرا والسماح للديدان بالتأقلم لمدة 20 دقيقة.
في نهاية فترة التأقلم، استخدم ماسحا ضوئيا مسطحا قياسيا لمسح كل لوحة صغيرة مرتين بأقل من 10 ثوان بين عمليات المسح الضوئي لتحليل عمليات المسح الضوئي، واستخدام برنامج مفتوح المصدر لمحاذاة المسحين التسلسليين والحصول على بيانات تغيير البكسل بين الصورتين ودرجة فحص الدودة النسبية لتحديد التغييرات في الاستجابة الحركية استنادا إلى كثافة الضوء التي ينتجها الماسح الضوئي عند تعيينها إلى بكسل عتبة خمسة. في هذا التحليل للنشاط الحركي C.elegans في قطرة واحدة من الوسط السائل ، أظهرت ديدان الأمراض المعقدة الميتوكوندريا I انخفاضا كبيرا بنسبة 38٪ في نشاطها الحركي في مرحلة L4 مقارنة بالديدان البرية. وبالمثل، أظهر تحليل مسح الديدان لنفس المجموعات السكانية انخفاضا كبيرا في النشاط الحركي للديدان نموذج المرض المرحلة L4 مقارنة مع N2 بريستول الديدان البرية من نوع.
ولوحظ أيضا فقدان نشاط القاطرة هذا في يوم الكبار مرحلة واحدة الميتوكوندريا المعقدة I الديدان المرض كما تم تقييمها من خلال تحليل مسح دودة. من الضروري أن نتذكر أن استخدام العدد الصحيح من الديدان عند إعداد كل المقايسة. بعد هذا الإجراء، يقوم مختبرنا في كثير من الأحيان بفحص المخدرات.
وتستخدم هاتان التقنيتان في مختبرنا لتقييم آثار الأدوية ذات الأهمية على نشاط الديدان في النماذج الحيوانية قبل السريرية لمرض الميتوكوندريا.
