مرحبا، اسمي غوربريت. مختبرنا يتحرى آليات التهاب الرئة وإصلاحها. مرحبا، اسمي جيسيكا وأنا التحقيق في الحويصلات الهوائية الفئران المختبر الناجم عن الأوزون باستخدام أساليب مجهرية الفلورسنت.
مرحبا بالجميع، اسمي مانبريت. وأدرس التهاب الرئة مع طرق التصوير الحيواني. تواجه الرئتين باستمرار الإهانات المباشرة وغير المباشرة ، الناجمة عن العقيمة ، مثل الأوزون ، والمكونات الميكروبية ، مثل شحم الدهون البكتيري أو LPS.
قد تؤدي استجابة المضيف الساحقة إلى تعرض التنفس للخطر وإصابة الرئة الحادة كما تتميز بتوظيف العدلات الرئوية ، بسبب المناعة المضيفة غير المنظمة ، والتخثر ، وإعادة عرض الأنسجة. نحن نصف تحليلا شاملا لمختلف المقصورات ، وهي سائل الحمم الهوائية - الحويصلات الهوائية ، وهو BAL ، وثقب الأوعية الدموية الرئوية ، أي LVP ، وأقسام التبريد في الرئة اليسرى ، والدم المحيطي ونخاع عظم القص والفخذ. بالنسبة للتعرض للأوزون ، ضع الفئران برفق في مربع التعريفي المخصص وعرض الفئران باستمرار إلى 0.05 جزء في المليون من الأوزون لمدة ساعتين.
بالنسبة للتعرض ل LPS ، قم بالتخدير الفئران تحت الكيتامين الخفيف داخل الصفاق ومزيج xylazine. الآن غرس 50 ميكرولتر قبالة حل LPS في الفئران nares الخارجية. غرس الفئران السيطرة مع 50 ميكرولتر من المالحة المعقمة.
في نقاط زمنية محددة، تخدير الفئران مع الجرعة الكاملة من الكيتامين ومزيج إكسيلازين. المقبل تطهير الفئران والتحقق من ردود الفعل دواسة، وهذا هو قرصة أي من أرقام الأطراف الخلفية، ومراقبة للتراجع عن الطرف. لا رد فعل يعني التخدير العميق.
الآن جعل قطع تحت القص وفضح القلب. ضع إبرة قياس 25 تعلق على حقنة الهيباريني في البطين الأيمن وسحب الدم عن طريق ثقب القلب. جمع الدم في المحاقن الهيبارين واستنزاف في أنابيب الميكروفون لمزيد من المعالجة.
استخدم الملاقط بعناية أو ملقط حاد لمسح منطقة القصبة الهوائية من الأنسجة المفرطة. الآن قطع من خلال القفص الصدري لفضح الرئتين. تمرير رباط القطن تحت القصبة الهوائية، وترك الأمر على هذا النحو في الوقت الحاضر.
قص القصبة الهوائية، متباعدة في حوالي ثلث طوله من الرئتين لاستئصال القصبة الهوائية. أدخل قنية البولي إيثيلين عيار 28 في القصبة الهوائية. ربط بحزم رباط القطن لعقد القنية في مكانها.
تأكد من عدم انهيار القنية. الآن حقن تدريجيا 0.5 مل من برنامج تلفزيوني في القنية بمساعدة حقنة مل واحد. بعد حقن PBS يستنشق المحاقن طالما أنها لا تقاوم الشفط.
جمع السائل يستنشق في أنبوب microphage المسمى، وتكرار هذا الإجراء مرتين أخريين. قطع الشريان الأورطي الصدري التنازلي في الموقع بين أنصاف الصدر والبطن لتجنب أي دعم أثناء تغلغل الرئة. لطخة تجويف بالقرب من قطع الشريان الأورطي نهاية خالية من الدم.
المقبل perfuse الرئتين مع 0.5 مل من درجة حرارة الغرفة المالحة heparinized، وحقنه من خلال البطين الأيمن. جمع متلازمة الأوعية الدموية من تجويف في نهاية قطع الشريان الأورطي الصدري تنازلي. بعد ربط الشعب الهوائية اليمنى، دع الرئة اليسرى تتضخم مع 0.5 مل من البارافورمالديهايد لمدة خمس دقائق.
الآن تعقيم جزء البطن. قطع جزء البطن و deskin ذلك من عظم الحوض. جمع عظم الحوض وعزل عظام عظم الفخذ الأيسر والأيمن في طبق بتري مملوءة المالحة أبقى على الجليد.
جمع القفص الصدري البطني والقص في طبق بيتري مملوءة بالملوحة، والتي يتم الاحتفاظ بها أيضا على الجليد. Perfuse قطع ينتهي من العظام مع أربع مرات مع 0.5 مل من المالحة باستخدام الإبر المجهزة بشكل جيد على 1 ML المحاقن. جمع الكسور من كل العظام في أنابيب فالكون المسمى، مزودة مرشحات ووضعها على الجليد.
طرد جميع العينات لمدة 10 دقائق في 3000 دورة في الدقيقة. جمع supernatants وفلاش تجميدها. إعادة تشكيل الخلايا في ما لا يقل عن 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
إجراء مجموع عدد الكريات البيض. وصمة عار سائل آخر من BAL مع مزيج من كالسين الأخضر والأحمر ethidium homodimer وصمة عار واحدة. تحليل supernatant لchemkines والتركيز الكلي للبروتين.
الطرد المركزي الخلايا لإعداد اثنين من السيتوسبينات على كل شريحة ووصمة عار للبروتينات الكيميائية الحيوية والمناعية. إجراء تعديل H و E تلطيخ على cryosections الرئة لجميع المجموعات. مخطط تفصيلي يدويا 150 إلى 200 خلية في لوحة الصور المدمجة.
نسخ المناطق المحددة التي تهم جميع القنوات. قياس المعلمات مسبقا لجميع القنوات. تقسيم كثافة الفلورسنت للجزيء الملون من قبل أن من DAPI أو CD61.
و يطلق على هذه DAPI أو CD 61 تطبيع نسب كثافة الفلورسنت. رسم المقبل المعلمات لتقييم أي تغييرات بعد التعرض. على الرغم من أن التعرض المشترك لم يحدث أي تغييرات في إجمالي عدد خلايا نخاع العظم BAL أو LVP أو القصي ، إلا أن الفئران أظهرت تليف الكريات البيضاء الجهازي في 24 ساعة ، والذي أعقبه زيادة الكريات البيضاء بعد 72 ساعة من التعرض.
يتم عرض هذه في عدد خلايا الدم الطرفية. تظهر تعدادات خلايا نخاع عظم الفخذ الارتفاع المتأخر عند 72 ساعة بالمقارنة مع جميع النقاط الزمنية. يرجى ملاحظة عدم وجود تلطيخ Siglec-F و CX3CRI في الخلايا متعددة الأشكال في 24 ساعة في صورة BAL cytospin.
وأظهرت السيتوسبينات BAL وLVP وجود خلايا CD11b و GR1 أحادية نووية إيجابية كبيرة في ساعة الصفر. الخلايا متعددة الأشكال قدمت كنوع الخلية السائدة في جميع المقصورات بعد التعرض. وكان إجمالي محتوى البروتين في BAL أعلى مستوى له بعد 36 ساعة من التعرض المشترك.
ومع ذلك، لم يتغير بروتين LVP بعد التعرض. وكانت مستويات eotaxin-2 وinterleukin-2 أعلى في أربع ساعات في LVP. تم تخفيض هذه chemokines في كسر BAL.
ومن المثير للاهتمام ، تم تغيير العدلات المقلقة IL-16 والعديد من chemokines الفطرية في LVP ، ولكن ليس كسر BAL. في خط الأساس أكثر من 95٪ من خلايا BAL كانت أحادية النووية تظهر أكتين القشرية، lamellipodia، والإجهاد وألياف التوبولين، وكانت إيجابية بقوة لانخفاض تلطيخ ميتوتراكر. في أربع ساعات، لاحظنا خلايا BAL دائرية، والتي فقدت actin، ولكن أظهرت انتشار شبكة microtubule كما هو مبين في تلطيخ mitotracker الأحمر وانخفاض أقل.
في وقت مبكر بعد التعرض مجتمعة، ظهرت خلايا BAL إيجابية مزدوجة للكالسيوم والإيثيديوم homodimer-1، مما يشير إلى الخلايا للخطر جزئيا. في 36 ساعة، كانت خلايا BAL قابلة للحياة إلى حد كبير، وهذا هو الأخضر. لاحظنا منفصلة ATP ألفا وLy6G تلطيخ في الضامة الحويصلات بال، والعدلات.
لاحظنا انخفاضا في DAPI تطبيع ATP ألفا وزيادة في محتوى بروتين Ly6G داخل الخلايا. تسبب التعرض مجتمعة تعبيرات عابرة من بال، الخلية القاتلة الطبيعية وK1.1، ATP العدلات، وحدة فرعية بيتا، عامل الانتشار، كي-67 والتعبيرات المستمرة من GR1 العدلات، الصفائح الدموية CX3CRI وبروتين الأنجيوستاتين المضادة للأحياء في خلايا BAL بعد التعرض. على الرغم من أنه كان من المتوقع تلف القصبات الهوائية والحاجز الحويصلات الهوائية ، كان من المستغرب مراقبة المجاميع الخلوية في الأوعية الكبيرة بعد 36 ساعة من التعرض.
وأخيرا، لدينا نتائج تلخيصية في هذا الجدول. نأمل أن يكون نموذج المورين لدينا بمثابة نموذج أولي يمكن الوصول إليه بسهولة ويمكن استنساخه في مختبرات الاحتواء من المستوى الثاني لدراسة آليات موت الخلايا الغازية والعدوى. شكرًا لك.
