يمكن استخدام هذه الطريقة للكشف بدقة وسهولة عن التعبير عن البروتينات المستهدفة في قلب حمار وحشي. يتم الكشف عن التغير في البروتين المستهدف مباشرة عن طريق قياس الفلورسينس المناعي. إجراء جمع جنين حمار وحشي وعلاجه، كما هو موضح في المخطوطة النصية.
في 72 ساعة بعد الإخصاب، نقل الأجنة إلى الشرائح الزجاجية، ومراقبتها تحت المجهر ستيريو. سجل تشوهات القلب، مثل وذمة التامور، وتغيير الحلقات وانخفاض الحجم. احسب معدلات التشوه وحلل الاختلافات بين المجموعات باستخدام طريقة واحدة ل ANOVA، يليها اختبار المقارنة المتعدد في تركيا.
بعد تخدير الأجنة مع 0.6 ملليغرام لكل ملليلتر MS222، سجل ضربات القلب لمدة 30 ثانية، وتحديد معدلات ضربات القلب باستخدام برنامج Image J. تشريح بعناية قلوب من أجنة السمك حمار وحشي مع إبرة حقنة المتاح تحت المجهر ستيريو. استخدم قلم حاجز مسعور لرسم دائرة على شريحة زجاجية نظيفة.
إضافة 50 ميكرولتر من 4٪ paraformaldehyde إلى 1.25 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لجعل حل التثبيت، ثم وضع ثلاثة قلوب تشريح في دائرة حاجز واحد الكاره للماء، واحتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. decant الحل تحت المجهر وتجفيف العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق على الأقل. غسل الشرائح ثلاث مرات في PBST لمدة خمس دقائق لكل غسل.
إضافة 50 ميكرولتر من BSA إلى 1000 ميكرولتر من PBST للحصول على حل 5٪ BSA، واحتضان الشرائح في غرفة رطبة لمدة ساعة واحدة لمنع ربط الأجسام المضادة غير محددة. decant الحل وغسل العينات ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة خمس دقائق لكل غسل. تمييع اثنين من microliters من الأجسام المضادة أحادية النسيلة الماوس ضد 8-هيدروكسيدوكسيجوانوزين واثنين من microliters من الأجسام المضادة متعددة النسيلة أرنب ضد غاما-H2AX في 296 ميكرولتر من PBST للحصول على حل كوكتيل الأجسام المضادة الأولية العاملة.
احتضان عينات القلب مع 50 ميكرولتر من محلول كوكتيل الأجسام المضادة الأولية في غرفة رطبة لمدة ساعة واحدة على الأقل في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. decant الحل وغسل العينات ثلاث مرات مع PBST لمدة خمس دقائق لكل غسل. تمييع واحد microliter من FITC المسمى الماعز المضادة للفأرة الأجسام المضادة الثانوية وmicroliter واحد من الماعز psy-3 المضادة للأرانب الأجسام المضادة الثانوية في 500 ميكرولتر من PBST للحصول على حل كوكتيل الأجسام المضادة الثانوية العاملة.
احتضان العينات مع الأجسام المضادة الثانوية لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. decant الحل وغسل العينات ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة خمس دقائق لكل غسل. إضافة 20 ميكرولتر من DAPI إلى عينات للتلطيخ النووي، واحتضانها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
ضعي زلة غطاء على الشريحة واغلقيها بطلاء الأظافر لمنع التجفيف والحركة. صورة العينات تحت المجهر الفلوري وتحديد إشارة الفلورسنت لمنطقة القلب باستخدام برنامج ImageJ. حساب التغييرات النسبية باستخدام متوسط نماذج التحكم DMSO وتحديد الأهمية الإحصائية للبيانات.
تم تقييم الأجنة المعرضة لPM 2.5 في غياب أو وجود مضادات الأكسدة، N-أسيتيل-L-السيستين، أو NAC، لوجود تشوهات في القلب. EOM من PM 2.5 تكلف زيادة كبيرة في تكوين المسخيات القلبية، مثل وذمة التامور، وتغيير الحلقات وانخفاض الحجم، مقارنة مع قلوب المعالجة DMSO السيطرة. كما انخفض معدل ضربات القلب بشكل كبير في الأجنة المعرضة ل EOM.
إضافة NAC مخففة عيوب القلب الناجمة عن EOM. تم استخدام فحص الفلورة المناعية لتقييم مدى تلف الحمض النووي في الأنسجة المعالجة بالحمض النووي EOM. تم زيادة مستويات التعبير 8-hydroxydeoxyguanosine و gamma-H2AX بشكل كبير في قلوب أجنة حمار وحشي تعامل مع EOM، مما يشير إلى زيادة في تلف الحمض النووي التأكسدي وفواصل حبلا مزدوجة الحمض النووي، على التوالي.
تم التصدي جزئيا للضرر الحمض النووي الناجم عن EOM عن طريق مكملات NAC. عند محاولة هذا البروتوكول، يجب الحرص عند غسل العينات باستخدام برنامج تلفزيوني، لأن قلب الحمار الوحشي قد يقشر الشريحة.
