إن توصيف بنية البروتين أمر ضروري لفهم وظيفتها. وقد برز قياس الطيف الكتلي كأداة قوية لهذا الغرض، وخاصة بالنسبة لأنظمة البروتين التي يصعب دراستها بالطرق التقليدية. لدراسة بنية البروتين حسب المواصفات الشاملة ، يتم إجراء تفاعلات كيميائية محددة في محلول يشفر معلومات هيكلية بروتينية في كتلته.
أحد النهج الفعالة بشكل خاص هو استخدام الكواشف التي تعدل بشكل مشترك حل الأحماض الأمينية التي يمكن الوصول إليها السلاسل الجانبية. هذه التفاعلات تؤدي إلى زيادات الكتلة التي يمكن توطينها مع دقة مستوى المخلفات عندما يقترن الهضم البروتيوليك وقياس الطيف الكتلي جنبا إلى جنب. هنا، وصفنا البروتوكولات المرتبطة باستخدام ديثيل بيروكربونات أو DEPC كمكشف وضع العلامات التكافؤ جنبا إلى جنب مع الكشف عن المواصفات الشامل.
DEPC هو جزيء كهربائي للغاية قادر على وضع علامات تصل إلى 30٪ من المخلفات في البروتين المتوسط ، وبالتالي توفير دقة هيكلية ممتازة. وقد استخدمت بنجاح DEPC جنبا إلى جنب مع المواصفات الشامل للحصول على معلومات هيكلية لكثير من البروتينات المختلفة. ابدأ بإعداد محلول عازل للبروتين الخاص بك من الفائدة بتركيز في نطاق عشرات الكائنات الدقيقة.
نحن عادة استخدام 10 ملليمولار pH 7.4 MOPS العازلة. بدلا من ذلك، قد يكون محلول البروتين الموجود تبادل المخزن المؤقت في MOPS أو مخزن مؤقت آخر إذا كانت العينة الأصلية تحتوي على مخزن مؤقت يحتوي على مجموعات وظيفية نيوكليوفيليا. من الضروري أن العازلة لا يكون المجموعات الوظيفية النووية لأنها سوف تتداخل مع رد فعل البروتين DEPC.
في microtube مختلفة، وإعداد حل الأسهم من DEPC 100 ملليمولار في أسيتونيتريل الجافة. إعداد محلول المخزون في أسيتونيتريل الجاف ضروري لمنع التحلل المائي من DEPC. في ميكروتوب جديد، وإعداد حل واحد imidazole الضرس في المياه HPLC الصف.
في الميكروبيوب الجديد، اخلطي العازلة MOPS ومحلول البروتينات. إلى البروتين وعازلة إضافة aliquot من محلول الأسهم DEPC التأكد من انها مزيج بشكل صحيح قبل وضع خليط رد الفعل في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة. يجب اختيار حجم محلول مخزون DEPC المستخدم استنادا إلى نسبة تركيز البروتين النهائية DEPC المطلوبة.
لا توجد مجموعة واحدة من تركيزات DEPC والبروتين التي ستعمل مع كل بروتين ، على الرغم من أن تركيز DEPC الأمثل يمكن تقديره استنادا إلى عدد بقايا الهستيدين واليوزين التي يمكن الوصول إليها الموجودة في البروتين. وتجدر الإشارة إلى أن حجم acetonitrile المضافة، وهو على نحو فعال حجم الحل DEPC المضافة لا ينبغي أن يتجاوز 1٪ من حجم التفاعل الكلي لتجنب اضطراب بنية البروتين أثناء رد الفعل. وقت رد الفعل هو في نهاية المطاف متروك للمستخدم، على الرغم من رد فعل دقيقة واحدة تحت شرط المثال يقلل من وضع العلامات على البروتين والتحلل المائي من DEPC.
بعد مرور دقيقة واحدة، إخماد رد الفعل عن طريق إضافة imidazole لمسح المتبقية على DEPC رد فعل. التأكد من أن التركيز النهائي للimidazole هو 50 مرة تركيز DEPC. لتحديد المخلفات التي تم تعديلها من قبل DEPC ، يجب هضم البروتين بروتيوكليتيكيا إلى شظايا الببتيد.
بالنسبة للهضم، اختر الشروط القابلة للبروتين المثير للاهتمام. الخطوات الشائعة التي يتم وصفها هنا تنطوي على البروتين تتكشف ومن ثم الحد من والروابط ثنائي الكبريتيد alkylating بحيث يمكن تحسين كفاءة الهضم. في تجربتنا، تتكشف البروتين مع denaturant والحرارة قبل الهضم يحسن كفاءة الهضم.
بينما يجري الكشف عن البروتين, قارن حلول TCEP و iodoacetamide في عازلة الهضم المناسبة. يجب استخدام TCEP كعامل تقليل بدلا من dithiothreitol أو DTT لأن DTT يمكن أن تتفاعل مع المخلفات المعدلة DEPC. Alkylation من الملفات الناتجة بعد التخفيض أمر ضروري لتجنب تسمية الهرولة التي الملفات الحرة والبروتين تتفاعل مع الأحماض الأمينية المعدلة.
بمجرد الانتهاء من الخطوة التي تتكشف، والحد من السندات ثاني كبريتيد عن طريق إضافة TCEP إلى خليط رد الفعل والسماح لها تتفاعل لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد التخفيض، إضافة iodoacetamide إلى خليط التفاعل، والسماح لها تتفاعل لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. يتحقق هنا عن طريق وضع خليط التفاعل في مربع.
التركيز النهائي من iodoacetamide ينبغي أن يكون ضعف التركيز المستخدم لتيسيب أو 80 مرة تركيز البروتين أو السندات ديسولفيد. إعداد إنزيم الفائدة, عادة تريبسين أو chymotrypsin وفقا لمواصفات الشركة المصنعة. بعد إعداد إنزيم الاختيار، ابدأ عملية الهضم واحتضان خليط التفاعل عند 37 درجة مئوية.
نسبة البروتين إلى الإنزيم 10:1 مع عملية هضم لمدة ثلاث ساعات باستخدام الإنزيمات المشلومة عادة ما تكون خيارا جيدا للبروتينات المسماة DEPC. بعد الهضم، يجب إما تحليل العينة فورا بواسطة LC-MS/MS أو فلاش مجمد بالنيتروجين السائل لتقليل تدهور العينة وفقدان التسمية. يمكن استخدام معلمات LC-MS/MS القياسية للبروتيوميات من أسفل إلى أعلى لتحديد المواقع المسماة على شظايا الببتيد البروتيوليكية.
وينبغي استخدام المرحلة العكسية C18 ثابتة لتحقيق أفضل فصل للببتيدات. في تجربتنا، يوفر LC الشعرية معلومات كمية أكثر موثوقية حول مستويات التعديل من نانو LC بسبب كميات العينة الأعلى المستخدمة. تتكون مرحلة LC المتنقلة النموذجية التي تستخدم لفصل الببتيدات المسماة DEPC من مذيبين.
المذيبات A هو الماء مع 0.1٪ حمض الفورميك والمذيبات B هو أسيتونيتريل مع حمض الفورميك 0.1٪. يتم استخدام elution متدرجة ويمكن تحسين وقت الفصل استنادا إلى تعقيد العينة. مطلوب مطياف كتلة قادرة على القيام LC-MS على الانترنت وMS / MS لتحديد مواقع تعديل DEPC على الببتيدات.
في تجاربنا، استخدمنا بنجاح عدة أنواع من مطياف الكتلة. لقد وجدنا أن Thermo Orbitrap Fusion يوفر نتائج ممتازة ، على الرغم من أن أي مطياف كتلي قادر على أداء MS / MS تلقائيا للعديد من الببتيدات أثناء تحليل LC-MS يجب أن يكون مناسبا. يجب تعيين شروط HPLC والمعلمات الطيفية الشاملة بشكل صحيح قبل القياس.
إذا تم تجميد العينة فلاش، ينبغي أن تذوب الحق قبل التحليل. بذل قصارى جهدكم لتقليل الوقت بين إعداد العينة وحقن HPLC. تحميل وحقن هضم عينة البروتين المسمى في نظام LC وبدء اكتساب LC-MS / MS أو تحديد موقع التسمية DEPC وكمية منطقة الذروة، توجد أساليب متعددة.
على أدوات ثيرمو فيشر، ربما تستخدم excalibur أو مكتشف البروتيوم. تعيين معلمات مناسبة لتعريف الببتيد في برنامج. يتم تضمين DEPC إضافة والكربوهيدراتايميثيل كتعديلات متغيرة تساعد على المخلفات أو تخصيصها.
وتستخدم مناطق الذروة الكروماتوغرافية للإصدارات المعدلة وغير المعدلة من الببتيدات لتحديد نسب تعديل مستوى المخلفات. DEPC وضع العلامات مع الكشف عن مرض التصلب العصبي المتعدد هو أيضا أداة قيمة لتميز أعلى ترتيب التغييرات الهيكلية للبروتينات. من دراستنا، يمكن وضع العلامات التكافؤ DEPC تحديد مناطق البروتين المحددة التي تخضع لتغيرات هيكلية على الإجهاد الحراري والأكسدي.
وفي الشكل، تظهر تغييرات كبيرة في نسب التعديل باللون الأزرق لانخفاض وضع العلامات والأحمر للزيادة في وضع العلامات، في حين تظهر المخلفات التي لا توجد بها تغييرات كبيرة في وضع العلامات باللون الأخضر الشاحب. على سبيل المثال، بعد تعرض بيتا-2 ميكروجلوبولين للإجهاد الحراري، العديد من المخلفات التي تخضع لانخفاض كبير في مدى وضع العلامات، N-terminus، سيرين 28، هيستيدين 31، سيرين 33، سيرين 55، سيرين 57، وليسين 58 هي أقرب من جانب واحد من البروتين مما يشير إلى أن هذه المنطقة من البروتين يخضع لتغيير تأكيدي أو ربما تتوسط. بعد تعرض البروتين للإجهاد التأكسدي ، والمخلفات المختلفة مع انخفاض في وضع العلامات ، سيرين 11 ، الهستيدين 13 ، ليسين 19 ، ليسين 41 ، وليسين 94 من مجموعة على مرحلة أخرى من البروتين مما يشير إلى أن الأكسدة تسبب في تغيير تأكيدي يحدث في مكان آخر.
هذه الدراسة لها آثار هامة على العلاج البروتين، والتي هي حاليا، الجزء الأسرع نموا في سوق الأدوية. وقد أظهرت أعمال أخرى من مجموعتنا أيضا أن DEPC الوسم التساهمي المواصفات الشامل يمكن الكشف عن وتحديد مواقع التغيرات التأكيدية في العلاجات الأجسام المضادة أحادية النسيلة وشدد. كما ترون، وضع العلامات التساهمية مع DEPC بسيط لتنفيذ تجريبيا، ولكن يمكن أن توفر معلومات هيكلية قيمة للبروتينات.
الدقة الهيكلية التي تقدمها DEPC وضع العلامات المواصفات الشامل متواضعة بالمقارنة مع تقنيات مثل التصوير البلوري بالأشعة السينية وNMR، لكنه قابل لأي بروتين تقريبا بغض النظر عن حجمه أو قدرته على أن يتبلور. DEPC التساهمي وضع العلامات المواصفات الشامل يعمل أيضا مع خليط البروتين ويمكن أن تعمل مع أنواع العينة معقدة جدا، مثل lysate الخلية وخلايا هاكات. بعد مشاهدة هذا الفيديو، ونحن واثقون من أن تجد DEPC وضع العلامات أداة مفيدة لتميز بنية البروتين.
