يوفر البروتوكول نموذجًا مباشرًا لتقييم السلامة المتشابكة بطريقة تعتمد على العمر. حتى نتمكن من دراسة الأمراض العصبية في الأنسجة التي هي قابلة للتحليل الهيكلي والوظيفي على حد سواء. هذه التقنية يسهل الحفاظ على كل من الأنسجة العصبية والعضلات من الوصلات العضلية الظهرية.
للتحقيق بشكل شامل وظيفة متشابك مع مرور الوقت والأنسجة التي يصعب العمل معها. يمكن تطبيق هذه الطريقة على دراسة الأمراض العصبية بما في ذلك ALS وباركنسون وهنتنغتون ومرض الزهايمر. قبل البدء في تشريح قطع ما يقرب من 10 ملليمترات من غيض من 200 ماصة ميكرولتر.
بعد إعطاء التخدير، ولعب ستة إلى 10 الذباب في طبق بيتري ستة سنتيمترات تحتوي على 70٪ الإيثانول واستخدام فرشاة الطلاء لرشفة بلطف دمج كل ذبابة. بعد دقيقة إلى دقيقتين ، استخدم ملقط لنقل ذبابة واحدة من الساقين أو الأجنحة إلى طبق تشريح مكسو بالسيليكون يحتوي على سبعة إلى 10 ملليلتر من PBS تحت مجهر تشريح. مع ذبابة مغمورة في برنامج تلفزيوني، واستخدام بلانت Dumont عدد خمسة العثور على ملقط لإزالة بعناية الأجنحة واستخدام تمتد على حافة مستقيمة تشريح الربيع مقص لجعل شق صغير في الجانب البطني من بشرة لإزالة الساقين.
عقد مقص تشريح في يد واحدة والملقط حادة في جهة أخرى، ووضع الجانب البطني ذبابة صعودا وعقد العينة في مكان مع ملقط، وإزالة الرأس والبطن مع مقص. استخدام 200 ميكرولتر ماصات تعيين إلى 40 ميكروليترس وتلميح الماصات المعدلة لجمع الثوريات ووضع عينات الأنسجة المعزولة في أنبوب المسمى بشكل مناسب تحتوي على 900 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني و 150 ميكرولترات من 32٪ الفورمالديهايد. بعد 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، استخدم ماصة باستور لإزالة المثبت وشطف البليوس ثلاث مرات مع 1.5 ملليلتر من برنامج تلفزيوني لكل غسل.
قبل البدء في bisections دون قفازات واقية ونظارات السلامة وملء قارورة جولة مع النيتروجين السائل. استخدام قواطع شفرة لانتزاع ريشة شفرة في زاوية وثني شفرة لكسر قطعة صغيرة. استخدام قواطع شفرة لقفل شفرة في الموقف واستخدام ماصة باستور الزجاج لإزالة كل من برنامج تلفزيوني من أنابيب العينة.
استخدم ملاقط التبريد لغمر الأنابيب في قارورة النيتروجين السائل. بعد 10 ثوان، واستخدام ماصة باستور لإضافة ما يقرب من 300 ميكرولترات من الجليد البارد PBS إلى كل أنبوب على الجليد، ووضع واحد الفقراء فأس الجانب البطني حتى في طبق تشريح مكسوة سيليكون 10 سنتيمترا التي تحتوي على الجليد البارد برنامج تلفزيوني. استخدام زوج مملة من ملقط لوضع الصدر والعثور على زوج من ملقط، لإزالة بعض من ganglia الصدر لفضح خط الوسط من الصدر.
باستخدام خط الوسط من الصدر كدليل، واستخدام اللعب لجعل قطع الضحلة من خلال ثلث الصدر واستخدام ملقط حادة لوضع الصدر في زاوية 45 درجة. استخدام شفرة لقطع مباشرة أسفل خط الوسط من الصدر للحصول على اثنين من hemithoraces وجعل بعناية واحد أو اثنين من التخفيضات لإزالة الأنسجة الزائدة دون إتلاف العضلات الطولية الظهرية. ثم ضع عينات الأنسجة العضلية في أنبوب المسمى بشكل مناسب من برنامج تلفزيوني.
عندما تم اقطع كل عينات الصدر permeabilize الأنسجة في عازلة سد لمدة ساعة واحدة على الأقل في أربع درجات مئوية. في نهاية الحضانة ، دواتكس أعدت حديثا حل وصمة عار الهيكلية وإضافة 150 microliters من وصمة عار لكل عينة لمدة ساعتين حضانة على دوار في درجة حرارة الغرفة في الظلام. بعد تلطيخ غسل العينات في PBST، ووضع خمس تسميات تعزيز مكدسة وقطع في نصف 15 ملليمتر بعيدا على شريحة واحدة المجهر الزجاجي.
استخدام تلميح ماصة صغيرة معدلة لنقل Thoraces على كل شريحة واستخدام مسح مختبر لإزالة أي PBST الزائدة. استخدام ملقط لترتيب العينات بحيث ثوراسيس تواجه الجانب العضلات حتى. عندما تكون العينات موجهة بشكل صحيح استخدام 200 دقيق 200 ماصة تلميح لتطبيق 70 ميكرولتررس من تصاعد المتوسطة لكل شريحة وتغطية كل شريحة مع زلة الغطاء.
ثم استخدام طلاء الأظافر لمعاطف بسخاء الحواف الخارجية للزلات الغطاء للحصول على ختم كامل حول كل نسيج. لتقييم النزاهة المتشابكة. يمكن أن تكون ملطخة تقاطعات الأعصاب العضلية مع بيروكسيديز الفجل وفلوي القصدير الخلايا العصبية موتور في بروتين ربط القطران من 43 كيلودالتون الطواه لديها القليل إلى أي بيروكسيديز الفجل تلطيخ بحلول اليوم 21، في حين أن البروتين نوع البرية لا تزال سليمة.
لا توجد اختلافات واضحة في تلطيخ العضلات. بالإضافة إلى تلطيخ الهيكلية الظهرية العضلات الطولية العصبية العضلية ينمي تقاطع يمكن أيضا توفير تقييم سلامة متشابك مع علامات ما قبل متشابك وما بعد متشابك. لاحظ أن تجميد فلاش النيتروجين السائل يسهل تقسيم ناجح لأن الأنسجة المجمدة غير فلاش أكثر عرضة للتلف أثناء التشريح.
بعد هذا الإجراء يمكن تحليل العينات المحافظة عن طريق المجهر confocal لقياس جوانب محددة من بنية متشابك.
