هذا البروتوكول لتغليف البويضات البورسين يجعل من الممكن الحفاظ على تنظيم كروية من COCs. وهذا يمنع تسطيحها وما يترتب على ذلك من تعطيل الوصلات الفجوة بين البويضة والخلايا الجريبائية المحيطة بها. المزايا الرئيسية للبروتوكولين الموصوفين هي أن هي سهلة الاستخدام وتسمح للسيطرة الفعالة على كل من البويضة والبقاء على قيد الحياة خلية العلاج الكيميائي.
كل من النظم الثقافة هي أدوات قيمة للبحوث الأساسية في البيولوجيا الإنجابية، وربما تكون ذات صلة سريرية لتحسين علاج العقم. ويمكن تطبيقها أيضاً لتطوير أساليب جديدة في مجال التكنولوجيا الأحيائية ولتحسين الثروة الحيوانية. بعد شطف المبيضين، ونقلها إلى منقار مملوءة HM المتوسطة وتخزينها في حاضنة في 38 درجة مئوية خلال جميع التلاعبات اللاحقة.
اضمّر السائل الجريب من بصيلات البورcine الكبيرة والطرد المركزي في 100 مرة G لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم، تصفية مُنَتَهَم باستخدام حقنة معقمّة موصولة بمصفّي مسام غشاء 0.2 ميكرومتر، ثم قم بتجميده بسرعة 80 درجة مئوية. لعزل COCs من بصيلات متوسطة الحجم، نقل اثنين إلى ثلاثة مبايض إلى طبق بيتري معقمة 10 سم مليئة HM. قطع بلطف سطح بصيلات المبيض جاحظ مع عدد جراحي معقمة شفرة 15، والتي سوف تسبب السائل الجريبي وCOCS لتدفق بها إلى طبق بيتري.
استلهم محتويات الجريبي مع إبرة قياس 28 متصلة بحقنة يمكن التخلص منها ، ونقلها إلى طبق بيتري آخر. لإعداد أطباق IVF Petri، أضف ملليلتر واحد من HM إلى الآبار المركزية، ووضع ثلاث إلى أربع قطرات من HM في الحلقات الخارجية. ثم استخدام ميكروسيبيت البولي لنقل COCs التالفة إلى قطرات من HM في الحلقات الخارجية، وشطف لفترة وجيزة لهم ثلاث إلى أربع مرات.
عند الانتهاء، بشكل فردي نقلها إلى البئر المركزية. تخزين لوحات التلقيح الاصطناعي في الحاضنة. إعداد حلول الخثار والفيبرينوجين كما هو موضح في المخطوطة النصية.
في يوم الإجراء ، ذوبان محلول الفيبرينوجين على الجليد ببطء ، واحضره إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام مباشرة. مزيج 0.5٪ الحل alginate والمحلول الفيبرينوجين بنسبة واحد إلى واحد لحجم النهائي من مليلتر ودوامة بلطف الخليط. إصلاح غرف الحضانة عن طريق تطبيق شرائط رقيقة من فيلم البارافين على الشرائح المجهر الزجاجي.
Pipette 7.5 قطرات ميكرولتر من خليط FA على شريحة الزجاج المغلفة فيلم البارافين مع فواصل فصل، ووضع ثمانية إلى 10 قطرات مرتبة في صفين. استخدام micropipette لنقل ثلاثة إلى خمسة COCs إلى مركز انخفاض الاتحاد الإنجليزي ، جنبا إلى جنب مع الحد الأدنى من حجم متوسط النضج. إضافة 7.5 ميكرولترات من حل ثرومبين على رأس كل قطرة FA لتغطية ذلك.
ليس هناك حاجة لخلطها لأن الجل يتشكل على الفور تقريبا. غطي غرفة الحضانة بشريحة زجاجية معدة مسبقًا، ثم اقلب الغرفة رأسًا على عقب ووضعها في طبق بيتري عيار 100 ملليمتر مبطن بورق فلتر رطب. وضع طبق بيتري في 5٪ ثاني أكسيد الكربون في حاضنة 38 درجة مئوية لمدة خمس إلى سبع دقائق.
بعد الاحتضان، نقل كل كبسولة FA إلى بئر من لوحة 96-well تحتوي على 100 ميكرولترات من متوسط النضج. كل يومين، استبدال نصف المتوسط مع الطازجة قبل- نضوج المتوسطة. يستخدم "صورة COC" مجهر ضوء مقلوب في التكبير 10x.
بعد زراعة COCs لمدة أربعة أيام، وإزالة المتوسطة النضج من الآبار وإضافة 100 ميكرولترات من 10 وحدات دولية لكل ملليلتر algenate في DMEM. اترك لوحة الثقافة في الحاضنة لمدة 25 إلى 30 دقيقة. إزالة COCs من كبسولات الذائبة.
غسلها في DMEM عدة مرات، ثم نقلها إلى حلقة الداخلية من طبق التلقيح الاصطناعي التي تحتوي على برنامج تلفزيوني. جعل سرير من خمسة غرامات من مسحوق FEP في طبق بيتري 30 ملليمتر. توزيع قطرة واحدة من متوسط النضج تحتوي على ثلاثة إلى خمسة COCs على مسحوق FEP.
تدوير لوحة بلطف في حركة دائرية لضمان أن الجسيمات تغطي تماما سطح قطرة السائل وتشكيل الرخام السائل، أو LMs. إعداد عدة 60 ملليمتر IVF بتري أطباق، وإضافة ثلاثة إلى أربعة ملليلتر من الماء المعقم إلى الحلقات الخارجية لإنشاء غرفة الرطوبة. التقاط LM شكلت مع ماصة 1000 ميكرولتر ووضعها في البئر المركزي.
احتضان الرخام لمدة أربعة أيام في 38 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون خمسة في المئة. لتغيير الوسط، قم بتطبيق 30 ميكروليترات من متوسط النضج على كل LM، مما يؤدي إلى انتشاره. عندما تذوب محتويات الرخام، نقل COCs صدر من المفاعل الحيوي إلى قطرة من متوسط نضوج جديد في طبق بيتري.
بعد ثلاثة إلى أربعة يغسل في وسط النضج، ونقل COCs، جنبا إلى جنب مع 30 ميكرولترات من المتوسطة الطازجة، على سرير مسحوق FEP. تدوير بلطف لوحة في حركة دائرية لضمان أن جزيئات مسحوق تغطي تماما سطح قطرة السائل وتشكيل LM.Then جديدة، ونقل LM إلى طبق بتري التلقيح الاصطناعي. أنتجت كل من نظم النضج في المختبر COCs مع خلايا الحبيبات التي تم الالتزام بها بإحكام لبعضها البعض وطبقات سليمة من خلايا الركام.
وقد أكد تحليل قابلية البقاء في COC أن ظروف النمو المثلى قد تحققت في كلا نظامي التغليف. في كلتا المجموعتين، لوحظت مواقع البويضات العالية القدرة على البقاء فقط. تم تصوير البويضات مع المجهر الإلكترون انتقال.
تم توزيع الميتوكوندريا بالتساوي وكان لها شكل يشبه القشرة. ولم يُمتد سوى عدد قليل منهم ولوحظ تجميعهم بشكل متقطع. ارتبط النتكولوم إندوبلاسميكي إما مع الميتوكوندريا أو مجانا في السيتوبلازم البويضية.
ظهرت قطرات السائل كما صغيرة، الظلام، هياكل مستديرة، وظهرت أجهزة غولجي مع cisternae المتوسعة. من المهم أن تكون دقيقة وحذرة عند نقل كبسولات FA من غرفة الحضانة إلى لوحات الثقافة وعند التقاط ونقل شكل LM في طبق IVF Petri.
