أنشأنا نموذجًا غنيًا بالكولاجين الفردي لمحاكاة البيئة التي تعاني منها الخلايا في الجسم الحي باستخدام تقنية الازدحام الضاوي. الجلد هو بيئة مزدحمة، على عكس البيئة السائلة التي نستخدمها بالفعل لزراعة الخلايا في المختبر. بالمقارنة مع نظام ثقافة الخلية الأحادية التقليدية، وهذا النموذج يعيد البيئة الجزيئية المزدحمة التي تواجه الخلايا في الجسم الحي، وخاصة في الأنسجة ندبة حيث مصفوفة غزيرة خارج الخلية يزيحم المياه السائلة.
إلى جانب الندوب الضخالية، يمكن استخدام تقنية الاكتظاظ الجزيئية هذه للدراسات حيث تكون المصفوفة خارج الخلية وفيرة، مثل التليف الرئوي. تنمو ندبة مشتقة و الليفية العادية وفقا لاتجاهات المخطوطات. ثم البذور لهم في 24 لوحات جيدا في 50،000 الخلايا في بئر في ملليلتر واحد من المتوسط.
احتضان لوحة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. إعداد الزحم الجزيئات أو وسائل الإعلام MMC عن طريق خلط فيكول 70, فيكول 400 وحمض الاسكوربيك في 10٪ FCS DMEM. احتضان وسائل الإعلام في حمام مائي لتفريق الجماهير في الحل.
ثم تعقيمه مع مرشح 0.2 ميكرومتر. استلهم الوسائط المستهلكة من الخلايا الليفية واستبدلها بوسائط MMC التي تم إجراؤها حديثًا. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة ستة أيام، وتغيير وسائل الإعلام MMC كل ثلاثة أيام.
إعداد حل سيريوس الأحمر عن طريق حل 0.2 غرام من مسحوق 80 الأحمر المباشر في 200 ملليلتر من الماء المقطر مع ملليلتر واحد من حمض الخليك. التعرق وسائل الإعلام MMC من الخلايا وإضافة 300 ميكرولترات من حل سيريوس الأحمر لكل بئر. ثم ارجع الخلايا إلى الحاضنة لمدة 90 دقيقة.
بعد الحضانة، شطف بلطف حل سيريوس الأحمر مع مياه الصنبور والسماح لصفيح الهواء الجافة بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، استخراج الأحمر سيريوس بإضافة 200 ميكرولترات من هيدروكسيد الصوديوم 0.1 الضرس في كل بئر وهز لوحة لمدة خمس إلى 10 دقائق. نقل 100 ميكرولترات من وصمة عار المستخرجة في لوحة 96 جيدا شفافة وقياس الامتصاص في 620 نانومتر مع قارئ لوحة صغيرة.
اغسل كل منها بشكل جيد مع 200 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني وإصلاح الخلايا مع الميثانول عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. ثم أضف 3٪ BSA إلى الآبار وحضن الطبق لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. استلهم محلول الحجب وأضف 200 ميكرولترات من الأجسام المضادة المضادة للكولاجين إلى كل بئر.
احتضان لوحة لمدة 90 دقيقة. ثم استلهم الجسم المضاد وغسل الآبار ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة خمس دقائق لكل غسل. أضف 200 ميكرولتر من الماعز المضادة للأرنب فيت سي الأجسام المضادة الثانوية وDAPI لكل بئر.
غطي الطبق بورق الألومنيوم ويحضنه لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تجاهل الأجسام المضادة الثانوية وDAPI وكرر يغسل مع برنامج تلفزيوني. ثم تصور الفلوريسنس مباشرة تحت المجهر.
بعد غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني، إضافة 40 ميكرولترات من العازلة تحلل في كل بئر وكشط طبقة الخلية مع طرف ماصة. ثم نقل البروتين إلى أنابيب أجهزة الطرد المركزي الصغيرة لقياس تركيز البروتين. تحميل 10 ميكروغرام من البروتين في كل بئر من أربعة إلى 12٪ البيس تريس هلام البروتين وتنفيذ SDS-PAGE في 200 فولت لمدة 30 دقيقة.
عند الانتهاء ، قم بنقل البروتين إلى غشاء نيتروسيلولوز عن طريق تشغيل لطخة غربية عند 90 فولت لمدة 90 دقيقة ، مع الحرص على تجنب تكوين الفقاعة بين الجل والغشاء. كتلة الغشاء مع 10 ملليلتر من العازلة حظر. ثم احتضانه مع الأجسام المضادة الأولية في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها.
في اليوم التالي، اغسل الغشاء خمس مرات مع 0.1 في المئة TBS توين 20 لمدة خمس دقائق لكل غسل. ثم احتضان الغشاء مع جسم مضاد ثانوي مناسب للأنواع لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. كرر الغسلات وتصور الفلوريسنس مع نظام التصوير.
بعد تنقية RNA الكلي مع طقم استخراج الحمض النووي الريبي التجاري، وقياس تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام مقياس الطيف الصغير الحجم. ثم استخدام مجموعة التوليف cDNA لتنفيذ أول تخليق الحمض النووي حبلا. مزيج من cDNA مع 10 ميكرولترات من سوبر ميكس الخضراء SYBR ونقل العينات إلى العرف 96 لوحة جيدا المغلفة مسبقا مع أوليغنوكليد التمهيدية.
اضبط الحجم الإجمالي إلى 20 ميكروليتر لكل بئر مع الماء واضبط RT-PCR وفقًا لتوجيهات المخطوطات. كثافة الخلية من الليفي الجلد البشري الخافتة التورّادة المستمدة من الندبة زاد بشكل ملحوظ بعد زراعة مع فيكول مقارنة باستخدام PVP أو التحكم. الزحمة الجزيئات مع فيكول في 9٪ كسور حجم شغل عزز بشكل كبير ترسب الكولاجين، بما في ذلك الكولاجين واحد، بالمقارنة مع غيرها من التركيبات.
وقد تجلى ذلك أيضا في التحليل الكمي. تم العثور على الخلايا الليفية المشتقة من الندبة والأبلوستات الجلدية الطبيعية المزروعة في بيئات MMC لتنظيم التعبير عن أنواع ECM بالإضافة إلى الكولاجين. وتجدر الإشارة إلى أن التعبير عن مصفوفة ميتاللوبروتيناسات أو MMPs قد وجد أنه يتراكم في أنسجة ندبه الضخام مقارنة بالأنسجة المحلية.
ولوحظ أن التعبير عن MMP2 و 9 و 13 كان منظما بشكل كبير في كل من الثقافات الخلية المزروعة في ظروف الاكتظاظ الجزيئية. MMPs تلعب دورا هاما أثناء التئام الجروح وتشكيل ندبة، وتنظيم الجمعية ECM وإعادة عرض. وكان تركيب عامل النمو البطانية الوعائية بين الخلايا الستة والأوعية الدموية غير قابل للكشف في لطخة غربية.
ولكن تحليل RT-PCR كشف أن التعبير عن إنترلوكين ستة كان منظمًا بشكل كبير ، في حين أن التعبير عن عامل النمو البطانية الوعائية كان منظمًا لأسفل في الخلايا الليفية المزروعة في ظروف MMC. عند محاولة هذا البروتوكول، من المهم جداً اختيار الخلايا الليفية الجلدية التي تحتوي على عدد قليل جداً من مسببات الأمراض CO. علينا أيضا أن نضع في اعتبارنا أن حمض الاسكوربيك هو عنصر أساسي في المتوسطة MMC.
نحن مهتمون بشكل خاص في مزيد من الكشف عن ترسب الكولاجين والمحاذاة في هذا النموذج MMC. ونحن نخطط لاستخدام تقنيات مجهرية متقدمة لمقارنة هذا النموذج في المختبر مع الأنسجة ندبة الأصلية في الجسم الحي. ونحن نشجع الآخرين على استخدام هذه التقنية الزحمة الجزيئات لتحسين أصالة في المختبر من الأنسجة مشروط المساعدة.
بالطبع، يمكن أيضا أن تستخدم الزحم الجزيئات لإعادة حساب نماذج من الأمراض والأمراض في المختبر.
