يمكن لهذا البروتوكول تقييم كيفية تأثير التسليم الجيني المستهدف على توطين الخلية B-1a ووظيفته ويمكن أن يكون دليلاً مفيداً على نهج المفهوم لدراسة الإمكانات العلاجية الجينية في الجسم الحي. وتوفر هذه الطريقة تسليماً جينياً مستقراً وفعالاً نسبياً لخلايا B-1a الأولية، وتسمح بتحديد النمط الظاهري للخلية المانحة، كما تتيح نقل وظيفة ما بعد التبنّي. يمكن استخدام هذه الطريقة لفحص عمليات متنوعة لخلية المانحين والمضيفين في الجسم الحي بما في ذلك بقاء الخلايا والانتشار والوظيفة ، ويمكن تطبيقها على أنظمة نقل تبني أخرى.
يمكن أن يكون حصاد السوائل البريتونية خادعًا. تأكد من فك الارتباط بدقة الخلايا لتحقيق أقصى قدر من الانتعاش وتجنب ثقب الأمعاء التي يمكن أن تلوث السكان الخاص بك الخلايا البريتونية. لجمع خلية البريتوني B-1، استخدم مقصًا جراحيًا مستقيمًا لإجراء قطع سطحي في بطن شخص يبلغ من العمر 12 إلى 14 أسبوعًا، ذكرًا، CD45.1+apolipoprotein E ماوس بالضربة القاضية، واستخدم مقصًا منحنيًا لقشر الجلد مرة أخرى لفضح الجدار البريتوني.
باستخدام حقنة 10 ملليلتر مجهزة بإبرة قياس 25 ، قم بمسح تجويف البريتوني بـ 10 ملليلترات من 37 درجة مئوية من 1640 دقيقة. وفهم قاعدة الذيل للسماح للماوس أن تهتز تماما من جانب إلى آخر لمدة 15 إلى 20 ثانية. بعد الاهتزاز ، استخدم الحقنة لpirate السائل من الجانب الأيمن السفلي من الصفاق فوق مستوى الورك مباشرة ، بالقرب من الأمعاء ، مع الحرص على تجنب تعطيل مستودعات الدهون الظهارية والأعضاء السفلية.
بعد جمع ستة إلى سبعة ملليلتر من المراحيض، الاستغناء السائل في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر على الجليد. استخدام ملقط لفهم الجدار الصفاقي فوق الحجاب الحاجز للسماح الارتفاع الرأسي للحيوان بحيث يبقى أي السائل المتبقية في الجزء السفلي من تجويف البريتوني. استخدام مقص الجراحية لجعل قطع صغيرة في الجدار البريتوني فوق الكبد دون قطع الكبد نفسه.
واستخدام الأنابيب الزجاجية ومصباح لجمع أي السائل البريتوني المتبقية. عندما تم جمع كل من السائل، aliquot الخلايا الاغتسال البريتوني من جميع الفئران وإضافة ما يصل إلى مرة واحدة 10 مرات إلى الخلايا الثامنة لكل تركيز الأنبوب في أنابيب 50 ملليلتر على الجليد. ورواسب الخلايا عن طريق الطرد المركزي.
Resuspend كل بيليه في ملليلتر واحد من المضادة لـ CD16/CD32 المضادة المخففة في نسبة واحد إلى 50 في العازلة المقايسة لاحتضان 10 دقيقة في أربع درجات مئوية. في نهاية الحضانة، إضافة حجم متساو من المزيج الرئيسي للأجسام المضادة الحيوية إلى كل أنبوب لاحتضان 20 دقيقة في أربع درجات مئوية تليها غسل في خمسة ملليلتر من المخزن المؤقت للمجاح في الأنبوب الواحد. Resuspend الكريات مع حجم مناسب من الميكروبات المضادة للبيوتين ومدة الحضانة المناسبة وفقا لتركيز الخلية وتوصية الشركة المصنعة تليها غسل عازلة خمسة ملليلتر في كل أنبوب.
Resuspend كل بيليه في 500 ميكرولترات من العازلة المقايسة ورئيس العدد المناسب من أعمدة الاختيار المغناطيسي مع ثلاثة ملليلتر من العازلة المقايسة لكل عمود. نقل الخلايا إلى أعمدة مهيأة جمع eluent التي تحتوي على الخلايا B-1 المخصب في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر على الجليد. ثم غسل كل عمود اختيار المغناطيسي مع العازلة إضافية فحص حتى الحجم الكلي الذي تم جمعه هو 10 ملليلتر وإعادة تركيز كسر الخلية بعد تنقية في مرة واحدة 10 إلى الخلايا السادسة لكل ملليلتر تركيز في الخلية B ثقافة المتوسطة.
لتحفيز الخلايا البريتونية B-1 جانبا مرة واحدة على الأقل 10 إلى الخلايا السابعة لمراقبة غير مستحث وتقسيم الخلايا المتبقية إلى اثنين من وحدات التخزين متساوية لتحويل. تمييع الخلايا إلى 1.5 مرة 10 إلى الخلايا الخامسة لكل 150 ميكرولترات من التركيز المتوسط وإضافة 150 ميكرولتر من الخلايا إلى آبار من لوحة واحدة مستديرة القاع 96 بئرا لحالة النقل. ثم إضافة 100 نانومولار من ناهض TLR9 إلى كل بئر ووضع لوحات في حاضنة ثقافة الخلية لمدة 16 إلى 18 ساعة.
بالنسبة لtransmoal transduction من البريتوني B-الخلايا ذوبان الكالسيوم الفوسفات transfection الأسهم الجسيمات الفيروسية على الجليد وعلى الفور إضافة إلى السيطرة وchemokine مستقبلات تكاثرية كبرى إلى كل بئر من لوحة مناسبة وتعدد العدوى من 20 إلى واحد في وجود 8 ميكروغرام لكل ملليلتر من البوليبرين وطازجة بيتا ميركباتول في 55 تركيز ميكروميكرال النهائي. عندما تم إضافة كافة الفيروسات، spinfect الخلايا عن طريق الطرد المركزي ووضع لوحات في الحاضنة ثقافة الخلية لمدة ثلاث ساعات. في نهاية الحضانة، حصاد الخلايا لإعادة الطلاء في خلية B جديدة المتوسطة واحتضان بين عشية وضحاها.
بعد الاستنفاد المغناطيسي لأنواع الخلايا البريتونية الأخرى ، تحتوي الخلايا المنفردة الحية في جزء ما بعد الاستنفاد على نسبة أكبر من خلايا CD19 + B مقارنة بالخلايا الضامة F4/80 + الضامة ، وعدم وجود خلايا CD5hi CD19-T ، وتحتوي على زيادة في تكرار خلايا CD19 + CD5 Medium B-1a مقارنة بكسر ما قبل الاستنفاد. والزيادة في وتيرة نجاح تحويل GFP + B-2، B-1، B-1a، وB-1b الخلايا الفرعية يرتبط مباشرة إلى الزيادة في تعدد الفيروس من العدوى. ويمكن زيادة كفاءة النقل باستخدام 96 لوحة جيدة مستديرة القاع مقارنة باستخدام 24-جيدا أو 6-آبار لوحات.
CXCR4-GFP نقل الفيروس الرجعي يمكن أن تحفز ناجحة B-1 CXCR4 الخلية overexpression وزيادة في الهجرة في المختبر نحو CXCL12 دون تأثير كبير على قابلية الخلية B. وبالإضافة إلى ذلك، تم نقل CD45.1++الخلايا المانحة بالتبني استمرت على التعبير الزائد عن الانبعاثات CXCR4 بعد تعافيها من نخاع العظم والطحال من فئران CD45.2 المتلقي 17 أسبوعا بعد نقل الخلايا. وتجدر الإشارة إلى أن هناك علاقة إيجابية بين تعبير CXCR4 وتوطين الخلية المانحة إلى نخاع العظم ولكن ليس الطحال قد تم تحديدها.
مع وجود ارتباط إيجابي لوحظ بين أرقام الخلايا المانحة في نخاع العظام وكمية البلازما من صبغة ليبوبروتين IgM مضادة للMDA-low densit. يمكن استخدام العديد من التقنيات الإضافية للإجابة على أسئلة مثل، ما هو تأثير تسليم الجينات المستهدفة على تطور المرض أو أي من الجهات المانحة التي تستمد العوامل المفرزة تؤثر على فسيولوجيا المضيف.
