ويمكن استخدام هذا البروتوكول للحصول على عدد كبير من أجهزة الاستشعار والخلايا الليفية الحركية والخلايا Schwann بسرعة. يمكن استخدام الخلايا التي تم الحصول عليها من خلال هذه الرسالة في دراسة تجديد الأعصاب وأمراض الجهاز العصبي. نظهر مظاهرة يمكن أن تمثل التجريبية لتحسين السيطرة على الوقت من التفاضلية خطوة الجهاز الهضمي وجعل الخطوات التجريبية أسهل لفهم.
لتنفجر استخدام مقص لجعل شق ثلاثة سنتيمترات، في الجلد من الظهر. إزالة العمود الفقري. افتح القناة الفقرية بعناية لفضح الحبل الشوكي.
الدانتيل الحبل الشوكي في طبق بيتري 60 ملليمتر، مع ثلاثة إلى أربعة ملليلتر من الجليد الباردة D هانكس حل الملح متوازنة تحت مجهر تشريح، استئصال الجذر البطني والجذر الظهري. وضعها في الجليد الباردة D هانكس متوازن محلول الملح. بعد إزالة HBSS، شريحة الأعصاب إلى ثلاثة إلى خمسة قطع ملليمتر، مع مقص.
إضافة ملليلتر واحد من 0.25٪ التربسين ونقل القطع العصبية إلى خمسة أنابيب أجهزة الطرد المركزي ملليلتر. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 18 إلى 20 دقيقة. بعد ذلك ، لوقف الهضم ، أضف في ثلاثة إلى أربعة ملليلتر من DMEM تحتوي على مصل الأبقار الجنينية 10٪.
الميوط الخليط صعودا وهبوطا بلطف حوالي 10 مرات. جهاز طرد مركزي في 800 مرة G لمدة خمس دقائق. بعد الطرد المركزي تجاهل المابير.
وإعادة تعليق الترسب في 2-3 ملليلتر من DMEM تكملها 10٪ FBS. تصفية تعليق الخلية من خلال مرشح شبكة 400، ومن ثم استخدام التعليق لتطعيم طبق بيتري 60 ملليمتر. احتضان أطباق بيتري لمدة أربعة إلى خمسة أيام في 37 درجة مئوية، في وجود 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
عندما تصل الثقافة إلى التقاء 90٪، قم بغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 1XPBS. ثم، لهضم الخلايا Schwann، إضافة ملليلتر واحد من 0.25٪ التربسين في 37 درجة مئوية لكل 60 ملليمتر طبق. بعد ثماني إلى 10 ثوان في درجة حرارة الغرفة، ووقف عملية الهضم، عن طريق إضافة ثلاثة ملليلتر من DMEM تكملها 10٪FBS.
لفصل خلايا شوان، ضربة بلطف على الخلية مع ماصة. تحقق من أن الخلايا منفصلة عن طريق المجهر. ثم جمع المتوسطة، التي تحتوي على خلايا البجعة، والطرد المركزي في 800 مرة G لمدة خمس دقائق.
تجاهل عظمى، وإعادة تعليق الترسب في ثلاثة ملليلتر من المتوسط. استخدم هذا التعليق لتطعيم أطباق بيتري غير المصقولة من 60 ملليمترًا، واحتضان الأطباق على درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 إلى 45 دقيقة. العلامات التجارية للوسط، والتي سوف تحتوي على خلايا شوان إلى طبق متوسط بولي L lysine المغلفة، واحتضان الطبق في 37 درجة مئوية لمدة يومين.
بعد إزالة المتوسطة التي تحتوي على خلايا Schwann غسل الخلايا الليفية، والتمسك أطباق بيتري مع 1XPBS. لهضم الخلايا الليفية، إضافة ملليلتر واحد من 0.25٪ التربسين في 37 درجة مئوية. بعد اتباع الهضم على المضي قدما لمدة دقيقتين في 37 درجة مئوية، وإنهاء عملية الهضم بإضافة DMEM تكمل مع 10٪FBS.
لفصل الخلايا الليفية، استخدم ماصة لتفجير على الجزء السفلي من الطبق. اجمع الوسط، بما في ذلك الخلايا الليفية، ونقلها إلى أنابيب الطرد المركزي. جهاز طرد مركزي الأنابيب في 800 مرة G لمدة خمس دقائق.
تجاهل عظمى، و resuspend الترسب مع مليلتر اثنين من DMEM تحتوي على 10٪ FBS. تلقيح الخلايا في غير مشفرة، 60 ملليمتر، أطباق بيتري، واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 إلى 45 دقيقة. عزل الخلايا الليفية التي ستلتزم أطباق بيتري، عن طريق إزالة وتجاهل متوسط النمو.
إضافة ثلاثة ملليلتر من DMEM تكملها 10٪ FBS. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة يومين حتى مرور الخلايا واحدة تصل إلى التقاء 90٪. كرر التفاضلية الهضم والالتزام.
بعد زراعة مرور الخلايا الليفية وخلايا Schwann لمدة يومين ، هضم الخلايا ، وجمعها ، والعد عليها. تلقيح PLL المغلفة الشرائح بتركيز واحد من 10 مرات من هذه الخلايا في بئر للطخ ICC. يظهر المجهر التباين في باي مورفولوجيا الخلايا الشوانة المزرعية والأضاء الليفية طوال عملية العزل.
بعد وقت طويل الثقافة، كانت تتجمع الخلايا Schwann معا بين الخلايا الليفية أو تقع على سطح الخلايا الليفية. بعد الهضم لمدة 10 ثوان ، كانت خلايا Schwann ، المشار إليها من السهام الحمراء ، مستديرة بينما ظلت الخلايا الليفية مسطحة وتم إرفاقها في الجزء السفلي من الطبق. بعد العزلة عن طريق الهضم التفاضلي والتقيد التفريقي لوحظت الخلايا المهزلة النموذجية لجميع أنواع الخلايا الأربعة.
الخلايا الليفية الحركية، الخلايا الليفية الحسية، خلايا شوان موتور وخلايا شوان الحسية. تم تصور الخلايا الليفية الحسية والحركية باستخدام مجهر مسح الليزر البؤري المخروطي. كانت الخلايا الليفية ملطخة بالأجسام المضادة ضد صبغة CD 90 X33342 تم استخدامها لتسمية نواة الخلية.
الصور المدمجة من الليفية المناعية وتلطيخ النووية، وأشار إلى أن 92.51٪ و 92.64٪ من CD 90 والخلايا ذات العلامات المشتركة ستي، كانت موجودة في الخلايا الليفية الحركية والحسية على التوالي. تم تصور خلايا شوان الحسية والمحركية باستخدام مجهر مسح الليزر confocal. كانت خلايا شوان ملطخة بالأجسام المضادة ضد صبغة S100 X33342 التي استخدمت لتسمية نواة الخلية.
أشارت الصور دمج من البجعة مناعة الخلايا وتلطيخ النووية وجود 91.61٪ و 93.56٪ من S100 والخلايا ذات العلامات المشتركة hexed في الخلايا الحركية والحسية Schwann، على التوالي. كما تم تحليل نقاء الخلية باستخدام عملية استئصال الخلايا المتدفقة. في الثقافات الليفية، كانت الخلايا الليفية حوالي 90٪ من الخلايا، التي تشير إليها M2 في الرسوم البيانية FCA بينما كانت الخلايا المتبقية خلايا Schwann.
في ال [سكهون] خلية ثقافات, أكثر من 92٪ كان خلايا [سكهون], ثانية يشير ب [إم2] في ال [كفو] رسوم بيانيّة, بينما ال بقية خلايا كانوا [فيلوستس]. ونادرا ما يكون هذا البروتوكول مفيدا لبدء آلية الاستشعار وتجديد الأعصاب الحركية للخلايا الليفية، وزرع الخلايا الشوان، لتعزيز تجديد الأعصاب.
