PBMC وعينات البلازما واضحة للحصول على وغنية بالمعلومات للغاية في التنمية السريرية في وقت مبكر. يقلل هذا البروتوكول القوي من التغير قبل التحليل الذي تم إدخاله في المواقع السريرية. هذا البروتوكول سريع وسهل، ويتطلب معدات مختبر أساسية وخبرة المشغل الحد الأدنى لمعالجة الدم في PBMCs والبلازما.
وهو متوافق مع أيام المختبر المزدحمة في المستشفيات. تحليل المصب لمكونات الدم الناتجة عن هذا البروتوكول يمكن أن تسترشد العلاقات الدوائية والدوائية، وجدولة جرعة الدواء وإثبات المشاركة المستهدفة وتقديم رؤى في آليات العمل المخدرات، ودعم كل من التحليل في الوقت الحقيقي والاستبطاني. نحن نستخدم هذا البروتوكول لدراسات الأورام، وتحديدا لتحليل آليات الاستجابة لأضرار الحمض النووي.
ومع ذلك، يمكن أن تكون المواد التي يجمعها هذا البروتوكول ذات صلة في العديد من مجالات المرض والطرائق العلاجية المتعددة. بعد تلقي ثمانية ملليلترات من دم المتبرع لكل عينة ، سجل الوقت الذي تم فيه سحب الدم وعكس كل أنبوب بلطف ثماني إلى عشر مرات قبل نقل عينات الدم المعالجة المضادة للتخثر إلى كل أنبوب من الأنابيب المسماة بالإشعاع. بالنسبة للعينات السريرية، تقوم بالطرد المركزي من الأنابيب مباشرة بعد قلبها.
ضع الأنابيب الرمادية 0.2 في خزانة الأشعة السينية الدافئة مسبقا ، أغلق الباب وطبق جرعة رمادية 0.2 على الأنابيب. استبدل الأنابيب المشععة ذات الجرعة المنخفضة بالأنابيب الرمادية السبعة وضبط الجرعة لتطبيق جرعة إشعاعية رمادية سبعة على عينات الإشعاع عالية الجرعة. بعد أن يتم تشعيع كلتا العينتين، احتضان جميع الأنابيب الثلاثة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
نقل العينات إلى أنابيب إعداد الخلية قبل فصل الخلايا مع الطرد المركزي عالي السرعة، مع التأكد من تعيين وحدات x ز أو ما يعادلها RCF. بعد الطرد المركزي، عرض الأنابيب على خلفية مظلمة لتحديد البلازما وخلايا الدم الحمراء وطبقات معطف برتقالي. باستخدام ماصة مصلية، نقل ما يقرب من نصف البلازما إلى جهاز طرد مركزي مخروطي مخروطي 15 ملليلتر دون إزعاج طبقة معطف بافي وتخزين أنبوب البلازما على الجليد الرطب.
ثم استخدم ماصة المراعي لنقل PBMC بأكملها التي تحتوي على طبقة معطف برتقالي إلى أنبوب جديد 15 ملليلتر وإضافة درجة حرارة الغرفة PBS إلى PBMC إلى حجم نهائي قدره 15 ملليلتر لكل عينة. اخلط الخلايا برفق عن طريق الانعكاس خمس مرات وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي بسرعة أقل ، مع التأكد من التحقق من وحدات الطرد المركزي. يستنشق جميع ما عدا آخر 500 ميكرولتر من supernatant دون إزعاج الكريات.
إضافة برنامج تلفزيوني جديد إلى حجم النهائي من 10 ملليلتر لكل أنبوب وإعادة الإنفاق عن طريق عكس بلطف الأنابيب. استخدام 40 ميكرولتر aliquots من الخلايا للعد. بعد العد، وجمع الخلايا مع جهاز طرد مركزي آخر وإزالة أكبر قدر ممكن من supernatant دون إزعاج الكريات.
لتخزين PBMC للمعالجة في وقت لاحق، resuspend الكريات في 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني الطازجة لكل عينة مع pipetting لطيف ونقل كل تعليق الخلية بأكملها إلى 1.5 ملليلتر المبردة المسمى على الجليد الرطب. ثم فلاش تجميد الخلايا من الطريقة المفضلة ووضعها في مربع تجميد في ناقص 80 درجة. سجل الوقت الذي تم فيه تجميد الخلايا.
بدلا من ذلك، إعادة إنفاق الكريات في خليط واحد ملليلتر أو تجميد لكل عينة ونقل تعليق الخلية إلى cryovials المسمى الفردية. ثم وضع الأنابيب وصناديق التجميد المبردة مسبقا لتخزين ناقص 80 درجة مئوية. لتجميد البلازما، إضافة ما يصل إلى واحد ملليلتر aliquots الكثير من البلازما إلى ما يصل إلى كل من خمسة اثنين من الأنابيب الدقيقة ملليلتر دون إزعاج بيليه المتبقية وتسجيل الحجم الإجمالي للبلازما في كل أنبوب.
ثم، تجميد على الفور aliquots البلازما في اتجاه تستقيم في الفريزر ناقص 80 درجة مئوية. لتحليل لطخة الغربية من العينات، resuspend بيليه في كل أنبوب مع حجم مناسب من العازلة تحلل تكملها مثبطات البروتيز والفوسفاتاز مساوية لتلك التي من حجم بيليه الخلية مع pipetting لطيف واحتضان عينات الخلية لمدة 10 دقائق على الجليد. في نهاية الحضانة، نقل العينات إلى أنابيب 1.5 ملليلتر وسونيكاتيه لهم مع ثلاث 30 ثانية على 30 ثانية من دورات في أربع درجات مئوية.
جمع العينات عن طريق الطرد المركزي ونقل الناطورات إلى أنابيب جديدة 1.5 ملليلتر. ثم، مزيج 40 ميكروغرام لكل عينة مع تحميل العازلة وغلي العينات لمدة خمس دقائق. تحميل 20 ميكروغرام من كل عينة لكل حارة في تكرار في هلام البروتين بيس تريس 4-12٪وتشغيل SDS-PAGE.
يختلف عدد الخلايا التي تم الحصول عليها من ثمانية ملليلترات من الدم وفقا لإعداد المريض والمرض. بشكل عام، بيليه الخلية صغيرة الحجم وشفافة بيضاء اللون. في بعض الأحيان الكريات يمكن أن يكون لها بعض تلوث خلايا الدم الحمراء، مما له تأثير سلبي على نوعية التحضير.
يختلف العائد النموذجي من مريض سرطان الدم الليمفاوي المزمن باستخدام هذا البروتوكول من 1.62 مرة 10 إلى الرابع إلى 1.99 مرة 10 إلى الخلايا التاسعة لكل ثمانية ملليلتر من إعداد الخلايا أحادية النوى مع تركيز بروتين نهائي يتراوح بين 1.62 إلى 19.77 ملليغرام لكل ملليلتر. وفي هذا التحليل التمثيلي لثلاث عينات من المرضى، لوحظت زيادة في التعديلات اللاحقة للترجمة بجرعات إشعاعية مؤينة أعلى. ومن المثير للاهتمام أن فوسفور الترنح -telangiectasia تحور وRAD50 كان كبيرا في جرعة منخفضة من 0.2 الرمادية، مما يشير إلى أن هذه التعديلات بعد الترجمية قد يكون من الممكن استجوابها كعلامات بيولوجية دوائية للعلاجات التي تنطوي على توليد فواصل حبلا مزدوجة الحمض النووي مع مجموعة ديناميكية جيدة في الورم، فضلا عن عينات الدم المحيطية.
لإعداد عينة الأمثل، معالجة الدم في غضون ساعة واحدة من جمع في درجة حرارة الغرفة، الطرد المركزي العينات بشكل صحيح، وعرض أنبوب على خلفية مظلمة لتكون قادرة على التمييز بين معطف برتقالي.
