ما نقدمه هنا هو طريقة قوية وبسيطة لتحليل ديناميات microtubule باستخدام الخلايا الحية الغزل القرص التصوير confocal في الخلايا متزامنة في prometaphase، ويتم تحليل الصور بعد ذلك على منصة MATLAB القائم. استخدام البروتين الفلورسنت الحمراء التحول في تركيبة مع المجهر القرص الغزل يقلل من السمية الضوئية. لذلك، يمكن تصوير عدد أكبر من الخلايا ضمن نفس التحضير.
يتم تغيير ديناميكية microtubule في عدد كبير من الحالات المرضية. ولذلك، فهم التنظيم وسلوك ديناميات microtubule في تلك العمليات يمكن أن تساعدنا على فهم آلية المرض، وفي نهاية المطاف، وتطوير العلاجات للتعويض عنها. والطريقة قابلة للارتقاء أيضا، لذلك يمكن تطبيقها في جهد اكتشاف المخدرات.
يمكن تعديل الأسلوب عن طريق تغيير بروتوكول desynchronization الفلوريسنس والحصول على خلايا من مراحل مختلفة من دورة الخلية. وهذا يمكن أن يكون مفيدا عند فحص المخدرات ضد microtubules وتحديد عيب في تقسيم والخلايا غير المنقسمة. فمن الضروري لتحسين بروتوكول transfection وكثافة البذر لكل نوع الخلية.
يجب أن يكون مستوى التعبير من EB3 منخفضة، من أجل الكشف عن ميكروتوبولس واحدة المتنامية. ابدأ بشطف خلايا HeLa المتنامية بشكل غير متزامن في DPBS ، ثم احتضانها مع التربسين -EDTA لمدة خمس دقائق ، عند 37 درجة مئوية. وقف التربسينات من خلال إضافة 1640 1640 1640 متوسطة مكمّلة مع 10٪ FCS المعطلة الحرارة في نسبة ثلاثة إلى واحد، وأضاف التربسين-EDTA.
حساب تركيز الخلايا وفقا لاتجاهات المخطوطات، والبذور 50،000 الخلايا في كل بئر من معدة، وأغطية الغرف. إعادة الغطاء إلى الحاضنة، وتنمو الخلايا لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي، وإزالة الخلايا من الحاضنة، وإسقاط من الحكمة إضافة 100 ميكرولترات من خليط transfection في كل بئر.
إعادة الخلايا إلى الحاضنة، وبعد أربع ساعات من الحضانة تكمل الخلايا مع المتوسطة الطازجة واحتضان بالإضافة إلى ذلك لمدة 20 ساعة. إعداد محلول 2.5 ميكرومولار من dimethylenastron, أو DME, في DMEM الأحمر الفينول, تكمل مع 10٪ FCS واثنين من المليمولار L-الجلوتامين. استبدال متوسط النمو في غطاء الغرف مع متوسط نمو DME، وإعادة الخلايا إلى الحاضنة.
بعد 3.5 ساعة من الحضانة، قم بنقل الخلايا إلى المجهر عن طريق تركيب غطاء الأغطية المغطى في غرفة بيئية من المقرر أن تكون 37 درجة مئوية و5٪ من ثاني أكسيد الكربون، مع لوحات داكنة للتصوير. ثم مواصلة الحضانة لما مجموعه أربع ساعات. قم بتنفيذ التصوير الزمني على مجهر مقلوب مع فتحة رقمية 100X و1.49 وهدف غمر الزيت ونظام ثنائي القرص والتركيز التلقائي الموثوق به.
حدد معلمات التصوير كما هو موضح في مخطوطة النص. العثور على خلية في الطور ، والتركيز في الطائرة Z المقابلة لمركز المغزل الماكر. ثم الحصول على الصور كل 5 ثوان، على مدى ما مجموعه دقيقة واحدة، مع عدم وجود binning ولا الإضاءة بين التعرض.
ابدأ بتحميل برنامج التحليل الرقمي وإضافة المجلد U-track V2.2.0 إلى مسار البحث عن البرامج، المسمى "محدد الفيلم" GUI، من نافذة الأمر. ثم استيراد الملفات الخام التي تم إنشاؤها بواسطة برنامج الحصول على الصور. أدخل الفتحة الرقمية للهدف والفاصل الزمني المستخدم في التصوير يدويًا.
بمجرد تحميل جميع الصور، حفظ سلسلة الفاصل الزمني دخلت كفيلم عن طريق تحديد حفظ كقائمة الفيلم، والخيار u المسار على الجانب الأيمن من نافذة الحوار. حدد ميكروتوبول زائد الأطراف من القائمة المنبثقة، وانقر فوق "حسناً"، الذي يفتح نافذة حوار جديدة لتحديد معلمات الخطوات الثلاث للتحليل. للخطوة الأولى، انقر فوق الإعدادات وحدد الكشف عن المذنب من القائمة المنسدلة.
حدد معلمات الفرق بين مرشح الغاوسيين وتجزئة مستجمعات المياه، كما هو موضح في المخطوطة. ثم حدد تطبيق الإعدادات على جميع الأفلام وانقر فوق تطبيق. للخطوة الثانية، حدد ديناميات الميكوتوبول زائد النهاية، واستخدم خيارات الإعداد لتحديد قيم الربط، وإغلاق الفجوة، والدمج، والتقسيم، ووظائف تصفية كالمان، وفقًا لمخطوطة النص.
بالنسبة للمشاكل المتعلقة بالبعد، اختر اثنين من القائمة المنسدلة، واستخدم خمسة إطارات لإغلاق الحد الأقصى للفجوة، وثلاثة إطارات لطول الحد الأدنى لشرائح المسار من الخطوة الأولى. كما كان من قبل، حدد تطبيق الإعدادات على جميع الأفلام وانقر فوق تطبيق. بالنسبة للخطوة الثالثة، اختر تصنيف ديناميكيات microtubule كأسلوب تحليل المسار، وحدد المعلمات من خلال زر الإعداد.
حدد المربعات لإزالة المسارات في بداية الفيلم ونهايته، وقم بإجراء مخططات الإحصاءات. من القائمة المنسدلة، حدد استخدام إطارين إلى ثلاثة قبل الفجوة الأمامية، والمئين 95 من توزيع سرعة الفجوة الأمامية، لإعادة التصنيف إلى الأمام والخلف، على التوالي. بمجرد تحديد كافة المعلمات، حدد تطبيق الاختيار / إلغاء تحديد لجميع الأفلام، وتشغيل جميع الأفلام مربعات من أجزاء التحكم u-المسار النافذة، ثم اضغط على تشغيل.
يتم عرض رسالة بمجرد اكتمال معالجة الفيلم. تم التعبير عن peb3-tdTomato plasmid بشكل عابر في خلايا هيلا. مزامنة الخلايا مع العلاج DME.
تم تحليل أفلام الوقت الفاصل من النمو microtubule، وسرعة النمو الناتجة ودينامية ورسمت. تم تعديل المعلمات الموصوفة للتأثير على التحليل ، مثل الحد الأقصى لطول الفجوة وعامل التقلص الأقصى ، لنفس المجموعة من أفلام الفاصل الزمني. وحُسبت القيم المقابلة لسرعة النمو ودينامية النمو.
وفي حين أن سرعة النمو الناتجة لم تتأثر بشكل كبير، فإن الدينامية كانت مختلفة عندما تم تعديل الحد الأقصى لطول الفجوة. وفي الحالات الثلاث جميعها، كان الكشف عن المسارات الفرعية الصغيرة مماثلة، ومع ذلك فإن إعادة بناء مسارات النقل المتعدد الوسائط الكاملة تأثرت في الغالب عندما تم تعيين الحد الأقصى لطول الفجوة إلى 15. من أجل تقييم ما إذا كانت ظروف التصوير تتداخل مع سلوك microtubule ، تم تحليل النصفين الأول والثاني من سلسلة الفاصل الزمني بشكل منفصل ، وتمت مقارنة سرعة النمو المقابلة وديناميكية.
وكما كان متوقعا، لم تكتشف أي اختلافات ذات شأن. من المهم أن نأخذ في الاعتبار، أن نظرا لأن الخلايا متزامنة في prometaphase، وكثافة microtubule عالية جدا. لذلك، على المرء أن يحدد بارامترات التحليل بعناية فائقة، وليس أن يخطئ في تحديد مختلف microtubule.
ويمكن مقارنة قياس ديناميات ميكروتومول مع هذه الطريقة مع دراسات الأهداف البيولوجية الأخرى بشكل مباشر، بشكل غير مباشر، وتنظيم microtubules.
