هذا البروتوكول هو تدفق بسيط على أساس قياس الخلايا المقايسة يسمح قياس الغشاء الميتوكوندريا المحتملة وكتلة الميتوكوندريا في الخلايا الحية. تفشل المعايرة الأيضية القياسية عند العمل مع مجموعات سكانية نادرة مثل الخلايا الجذعية للدم. هذه الطريقة تمكن المستخدمين من التنميط الغشاء الميتوكوندريا عند العمل مع عدد قليل من الخلايا وتحديد التعديلات الأيضية الجديدة من الخلايا مثل HSCs.
وعلاوة على ذلك، يمكنك الجمع بين ذلك مع المقايسات الوظيفية المصب مثل زرع نخاع العظم أو القولون تشكيل المقايسات لتحديد وظيفة الخلايا الخاصة بك بعد الثقافة. يمكن استغلال تقنيتنا لتحديد جزيئات جديدة قادرة على تحسين وظيفة HSC في سياق زرع نخاع العظم والانتعاش المناعي الدموي بعد العلاجات الاستئصالية. كما هو موضح في بروتوكول لدينا، يمكن استخدام طريقتنا لتقييم اللياقة الأيضية للخلايا التائية المناعية.
من المهم جدا أن الخلايا لديها الحد الأدنى من التعرض للضوء بعد تلطيخ. وعلاوة على ذلك، استخدام مثبطات المضخة فيراباميل يجب أن تدرج من أجل تقييم مساهمة efflux مضخة. ومع ذلك، المستخدمين يجب أن تكون على علم بأن فيراباميل اضطرابات عميقة التوازن الأيونية ولا يمكن استخدامها من أجل تقييم تأثير المغير الأيضي على إمكانات غشاء الميتوكوندريا.
العرض التوضيحي المرئي لهذا الأسلوب مهم للغاية لأن هناك بعض الخطوات الهامة التي يحتاج المرء إلى وضعها في الاعتبار عند العمل مع عدد قليل من الخلايا، وهذه الخطوات مفقودة في كثير من الأحيان في الأوراق العادية التي يقرأها المستخدمون على PubMed. بالنسبة لفرز FAC ، يتم تحديد السكان LKS ، التي تم تعريفها من قبل النسب السلبي ، Sca1 إيجابية ، cKit إيجابية. يتم تحديد الخلايا الجذعية للدم من حوالي 5 إلى 10٪ من الخلايا في السكان LKS عن طريق الغاء لD150 إيجابية, CD48 السكان السلبية, وصفت بأنها HSCs.
بعد فرز الخلايا الجذعية الدموية، الطرد المركزي الأنابيب في 300 مرات ز لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية. إزالة بلطف معظم من افراط دون طرد بيليه، وترك 50 إلى 80 ميكرولترات على رأس بيليه الخلية. Resuspend بيليه الخلية في توسيع الخلايا الجذعية المتوسطة إلى حجم النهائي من 200 ميكرولترات.
إعداد زراعة الأنسجة العقيمة معالجة 96 يو القاع لوحة جيدا، وتحديد الآبار حيث سيتم زراعة الخلايا. نقل 100 ميكروليتر من 2x متوسط القاعدية أعدت سابقا في هذه الآبار. في NR ملحوظ بشكل جيد، إضافة اثنين من ميكرولترات من محلول ريبوزيد نيكوتيناميد 100x.
نقل 100 ميكرولترات من 2x متوسط القاعدية إلى آبار للسيطرة على تلطيخ. بذور 100 ميكرولترات من الخلايا الجذعية محضرة الدم على رأس الآبار التي تحتوي على 2x المتوسطة القاعدية. بذور 100 ميكرولترات من خلايا نخاع العظام كله على الآبار ملحوظ كضوابط تلط.
أضف 200 ميكرولترات من المياه التي يتم تزخر بها في جميع الآبار المحيطة لتقليل التبخر من الآبار التي تحتوي على خلايا. ضع الطبق دون عائق في حاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 72 ساعة. أخرج الطبق لتجديد ريبوزيد نيكوتيناميد كل 24 ساعة، ووضعها مرة أخرى في الحاضنة.
في نهاية فترة الثقافة، إضافة اثنين من ميكرولترات من 100x TMRM الحل واثنين من ميكرولترات من 100x الأخضر الفلورسنت حل وصمة عار في كل من آبار الاختبار. إضافة اثنين microliters من 100x TMRM في TMRM تلطخ السيطرة جيدا. إضافة اثنين microliters من 100x بقعة الفلورسنت الخضراء في التحكم في تلطيخ MitoTracker جيدا.
تغطية الجزء العلوي من لوحة مع رقائق الألومنيوم. ووضع لوحة مرة أخرى في حاضنة في 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 45 دقيقة. قم بإزالة اللوحة من الحاضنة، وطاردة مركزية عند 300 مرة ز لمدة خمس دقائق.
عكس لوحة لإزالة عظمى، وإضافة 200 ميكرولترات من المخزن المؤقت FACS القياسية إلى resuspend. غطي الطبق بطبقة. الطرد المركزي لوحة في 300 مرة ز لمدة خمس دقائق.
كرر هذه الخطوة الغسيل ثلاث مرات. إعادة تعليق الخلايا في 200 ميكرولترات من العازلة FACS، ونقلها إلى أنابيب FACS. لتشغيل العينات على مقياس التدفق، قم أولاً بتحميل عناصر التحكم اللونية المفردة في الجهاز، وسجل على الأقل 5000 حدث في كل واحد تلو الآخر.
في البرنامج، اضغط على الحصول ثم سجل على لوحة المعلومات للحصول على وتسجيل عناصر تحكم لون واحد. اضغط على إعداد التعويض، ثم انقر فوق حساب التعويض لحساب التعويض. وبمجرد تطبيق التعويض، الحصول على عينة الخلايا الجذعية للدم، وتسجيل أكبر عدد ممكن من الأحداث.
قم بتصدير ملفات FACS من مقياس المقاييس، وافتح الملف على برنامج التحليل. على FlowJo، استخدم مبعثر إلى الأمام والجانب مبعثر لتحديد مجموعة الخلايا. تعريف العزاب في البوابات التالية ثم قم برسم الكسر السلبي DAPI الذي يمثل الخلايا الحية.
في بوابة الخلية الحية، قم بعمل مؤامرة كفاف في TMRM وقناة وصمة عار الفلورسنت الخضراء لقياس إمكانات الغشاء الميتوكوندريا والكتلة، على التوالي. تصدير شدة الفلورس متوسط من هاتين القناتين في بوابة الخلية الحية. ثم، تصدير نسبة الخلايا في بوابة TMRM منخفضة في جميع العينات.
أظهر علاج الريبوزيد نيكوتيناميد زيادة واضحة في عدد السكان المنخفضين في TMRM. كما زاد بشكل كبير من نسبة الخلايا في بوابة TMRM المنخفضة وأظهر انخفاضًا كبيرًا في شدة الفلورية TMRM. لم يتغير كتلة الميتوكوندريا على مكملات الريبوزيد نيكوتيناميد.
بالإضافة إلى ذلك، تم دمج تلطيخ علامة الخلايا الجذعية مع تلطيخ الميتوكوندريا بعد الاستزراع. مع استراتيجية البوابات لتحديد الخلايا الجذعية للدم، أظهر التعرض للريبوزيد نيكوتيناميد زيادة كبيرة في عدد السكان المنخفض TMRM وانخفاض كبير في كثافة الفلورية TMRM في HSCs المسور. وظلت الإشارة الخضراء الخضراء للض stain الميتوكوندريا الخضراء دون تغيير في الشرطين.
من المهم تغطية لوحة تلطيخ مع رقائق الألومنيوم من أجل تقليل التعرض للضوء لعينات ملطخة. يمكن الجمع بين هذه الطريقة مع المقايسات المصب مثل زرع نخاع العظم ومقولات تشكيل مستعمرة لتحديد وظيفة الخلايا الجذعية الخاصة بك. لذلك يسمح هذا الأسلوب طريقة بسيطة لفحص لتحديد التعديلات الأيضية رواية من HSCs.
