هذا البروتوكول مهم لخلق وتحديد الطفرات المطلوبة العقل والجسم في الجينوم من aeruginosa Pseudomonas، فضلا عن اختبار تأثير الطفرات على الحد من الفوعة في نموذج الماوس استنساخها. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي التحقق من صحة الكروم وإعادة إنتاج نموذج عدوى الماوس. البكتيريا تعمل باستمرار، تتغير باستمرار.
لإبطاء هذه العملية، ونحن نستخدم توقف المجمدة، كيس منهم، شنق لهم على درجات متعددة على التعديل قبل اختبارها في نموذج الماوس. شخص غير مألوف مع هذه الأساليب سوف النضال على الأرجح مع التنمية واختيار إعادة المؤتلف المحتمل كروس لاختبار. وعلاوة على ذلك، فإن التعامل مع الفئران للعدوى يكون من الصعب على شخص غير مألوف مع العمل الحيواني.
يمكن تطبيق هذه الطريقة لاختبار مسببات الأمراض الأخرى والمسوخ ، وكذلك تصيب الفوعة في الفئران. وبالمقارنة مع النماذج الحالية، فإن الإجراءات التي لها قابلية الاستنساخ بالإضافة إلى التحقق من صحة الاستنساخ قبل وبعد العدوى يمكن أن تفيد المحققين الآخرين في هذا المجال. يقدم العرض المرئي لهذا البروتوكول نظرة ثاقبة على إجراءات واسعة النطاق قد يصعب فهمها أو فهمها من خلال القراءة وحدها.
ابدأ بزراعة مستعمرات واحدة، مُؤتلفة في مرق العزلة Pseudomonas، أو PIB. تلقيح و streak 10 microliters من كل ثقافة على لوحات PIA ساخنة قبل, تكمل مع 10٪ السكروز. ثم احتضان لوحات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
في اليوم التالي، قم بإزالة اللوحات من الحاضنة وتفقدها من أجل النمو. يجب أن تكون مستعمرة مقاومة السكروز إعادة الكومبينات المزدوجة. استخدام المسواك المعقمة لتصحيح ما لا يقل عن 20 مستعمرات على لوحات ما قبل warmed من PIA، PIA تكملها 10٪ السكروز، و PIA تكملها مع كاربينيسيلين.
احتضان لوحات بين عشية وضحاها وفحصها للنمو في اليوم التالي. سوف صحيح إعادة الكومبينا الكروس أوفر مزدوجة تكون كاربينسيلين حساسة ومقاومة السكروز. الشاشة 10 إلى 20 مستعمرات للحذف، وذلك باستخدام مستعمرة PCR.
التقاط نمو يشتبه في كروس مزدوج المؤتلف مع مسواك معقمة وتعليقه في 50 ميكرولترers من برنامج تلفزيوني. يغلي التعليق في 100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. جهاز طرد مركزي لمدة ثلاث دقائق في 13،000 مرات G ووضعها على الجليد.
ثم قم بإجراء PCR وفقًا لتوجيهات المخطوطات. بمجرد الانتهاء PCR، أداء Agarose هلام الكهرباء على المنتجات. وتشير منتجات التضخيم الأصغر حجما إلى المستعمرات التي حذفت فيها المنطقة موضع الاهتمام.
في صباح الحقن، ذوبان cry الخلايا البكتيرية عند أربع درجات مئوية لمدة ثلاث إلى أربع ساعات. الحفاظ على قارورة على الجليد بعد ذوبان وحقن الفئران في غضون ساعتين. نقل محتويات كل cryovial إلى أنبوب ملليلتر جديد وطاردة مركزية في 4، 500 مرات G لمدة 10 دقائق.
تجاهل عظمى وإعادة تعليق بيليه الخلية في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني. كرر الطرد المركزي وإعادة تعليق الخلايا في برنامج تلفزيوني إلى تركيز نهائي من 2.5 مرة 10 إلى وحدات القولون التاسعة تشكيل لكل ملليلتر. أخذ ثلاث عينات من التعليق النهائي لكل سلالة للتحقق من التركيز، واType، وphenotype.
لكل سلالة، aliquot 1.5 ملليلتر من تعليق الخلية في أنبوب ملليلتر وإعداد برنامج تلفزيوني لحقن التحكم. جمع الفئران والمواد اللازمة للحقن في غرفة جراحية حيوانية معقمة ومسح جميع الأسطح مع مناديل التعقيم قبل البدء. ارتداء اثنين من أزواج من قفازات اللاتكس للحد من خطر ثقب, إذا عض, فضلا عن معطف مختبر, نظارات السلامة, وقناع الوجه.
إزالة الماوس من القفص ووزنها، ووضع علامة على الذيل مع علامة دائمة لتتبع ما بعد الحقن. فتح حقنة واحدة ملليلتر جديدة مع إبرة قياس 27 ورسم 200 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني عقيمة. الاستيلاء على الماوس وراء أذنيه، وذلك باستخدام الإبهام والسبابة، وقرصة لخلق أضعاف الجلد في مؤخر الرقبة.
ثم، تأمين الذيل في النخيل باستخدام الخنصر لعقد الماوس شقة وغير متحركة. أدخل الإبرة بزاوية 30 درجة في تجويف الصفاق إلى يسار أو يمين خط الوسط. رفع قليلا الإبرة لضمان عدم إدراجها في الأجهزة.
ثم، ببطء حقن برنامج تلفزيوني وسحب الإبرة. بولوس في موقع الحقن هو نموذجي. ضع الإبرة في حاوية التخلص من النفايات الحادة المعينة وتحريك الماوس إلى قفص منفصل.
كرر الإجراء مع الماوس التالي وبعد حقن كل الفئران من قفص واحد، ونقلها مرة أخرى إلى قفص الأصلي. بعد حقن مجموعة التحكم، قم بإدخال مجموعات الاختبار باستخدام نفس الإجراء. مرة واحدة كل الحقن كاملة، والعودة الفئران إلى غرفة السكن وتنظيف منطقة العمل مع مناديل التعقيم.
لتصوير الحيوانات، قم بإعداد نظام التصوير من خلال وضع معلمات الكاميرا وتسخين المسرح. تعيين تدفق الأكسجين إلى 1.5 لتر في الدقيقة وisoflurane إلى 3.5٪، وتحريك الماوس إلى غرفة التخدير، ثم إلى درجة حرارة مستقرة المرحلة، بعد التخدير. ضع الماوس على ظهره مع الذراعين الممدودين وتناسب مخروط الأنف لإدارة 2.5٪ isoflurane أثناء التصوير.
أغلق الباب واصطُلم صورًا بيولوجيًا وأشعة سينية من الفأرة. عند اكتمال التصوير، ارجع الماوس إلى قفصه وراقبه. وينبغي أن يستعيد وعيه في غضون ثلاث إلى خمس دقائق.
تم تأكيد عمليات حذف الجينوم المستهدفة من قبل مستعمرة PCR مع التمهيديات المحددة التي تضخيم المنطقة من الاهتمام. المستعمرات مع حذف الجينوم تسفر عن أقصر الفرقة PCR مقارنة مستعمرات نوع البرية. الحقن داخل الصفتون من سلالة مخففة من P aeruginosa, PGN خمسة, أدى إلى 0٪ الوفيات, أي ما يعادل الوفيات لوحظ مع E.coli BL 21.
ومع ذلك، كان حقن سلالة الوالدين قاتلاً بنسبة 80٪ من الفئران. تم تتبع تطور العدوى باستخدام الوالدين البيوميلينسي ملحوظ وسلالات مخففة. وظلت السلالة المخففة موضعية في موقع الحقن حتى تلاشى التخمة الحيوية، والتي من المرجح أن تتزامن مع إزالة العدوى.
الطريقة المقدمة لم تفحص سوى معدل الوفيات الناتج عن السلالة. ويمكن استخدام المزيد من الجوانب المناعية والسمية في العمق لتحديد ديناميات العدوى والأثر النهائي للعدوى الذي لا يؤدي إلى الوفاة. أهم شيء في الإجراء هو التحقق الشامل الذي تم ، بين خطوات مختلفة من تحديد الهوية الأولية إلى اختبار الحيوانات.
قد يؤدي فقدان بعض خطوات التحقق من الصحة إلى نتيجة خاطئة، حيث أن السلالات التي تم اختبارها قد تخضع للطفرات والاختيار، أو تصبح ملوثة. مع تطوير هذه التقنيات اثنين، ونحن نعتقد أن هذا سيسمح الباحثينا في مجال علم المناعة العدوى للتحقيق بشكل أكثر فعالية كيف التفاعل حزمة قوية يؤدي إلى النمط الظاهري المدقع، sepsis، والوفيات. يمكن مقارنة مختلف nutrients'impact على المتغيرات من خلال حجم الزَنَة من البكتيريا.
