هذه الطريقة هامة لأنه لا يوجد بروتوكول آخر يسمح الحمض النووي الريبي توليفها حديثا ليتم تحليلها في مثل هذا النطاق الزمني القصير، والسماح تجارب النبض مطاردة مع مثل هذا النبض القصير. يعمل هذا البروتوكول بشكل جيد مع استنفاد البروتين، مثل بروتوكول أفضل AID 4U. الميزة الرئيسية هي أن الخلفية منخفضة.
وهذا يسمح لأوقات وضع العلامات قصيرة، عن طريق إزالة تقريبا كل الحمض النووي الريبي غير ناول. كما يفصّل البروتوكول المكتوب العديد من أنواع التجارب المختلفة التي يمكن إجراؤها وكيفية دمجها في هذه التقنية. لبدء هذا الإجراء، تنمو الخميرة في YMM المتوسطة إلى 600 OD بين 0.6 و 0.8.
في غطاء الدخان، أضف ميثانول يعادل 30 إلى 50٪ من حجم العينة المقصود إلى أنبوب 50 ملليلتر. أغلق الأنابيب بإحكام، وضع علامة عليها، ووضعها على الجليد الجاف للبرد. بعد ذلك، تسمية أنابيب مليلتر لتخزين العينات على المدى الطويل ووضعها على الجليد لتبرد.
إضافة حبات الزركونيا إلى أنابيب ملليلتر اثنين. يبرد على الأقل ملليلتر من الماء لكل عينة على الجليد. إذا كان سباج S.pombe هو أن تضاف إلى الثقافة، ووضع aliquot من thiolated S.pombe الخلايا على الجليد للذوبان.
دوامة aliquot المذابة وإضافته إلى الثقافة. ثم إضافة 4tU إلى الثقافة إلى تركيز 10 ميكرومولار ومزيج بقوة. ثيو التسمية لمدة زمنية تتراوح بين 15 ثانية وخمس دقائق.
أخذ عينات من الثقافة على فترات منتظمة إلى نهاية الدورة الزمنية. تضاف كل عينة إلى أحد أنابيب الطرد المركزي المعدة التي تحتوي على الميثانول. ختم كل أنبوب، يهز لخلط جيدا، ووضعها على الجليد الجاف.
بمجرد أخذ كل العينات، ضعها كلها على الجليد. تأكد من أن أيا من العينات قد جمدت. إذا كان أي قد جمدت، والدفء لهم بلطف في اليد في حين عكس باستمرار.
أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 3،000 مرات ز وعلى أربع درجات مئوية لمدة دقيقتين ل بيليه الخلايا. صب قبالة السائل، وإعادة تعليق بيليه في ما لا يقل عن ملليلتر من الماء البارد الجليد عن طريق الأنابيب بقوة صعودا وهبوطا. نقل التعليق إلى أنبوب غطاء المسمار المعدة ووضع الأنبوب على الجليد.
أجهزة الطرد المركزي العينات لفترة وجيزة في سرعة أكبر من 13،000 مرات ز لإعادة بيليه الخلايا. ثم ضعها مرة أخرى على الجليد، وإزالة السائل. أولا، إضافة في 400 ميكرولترات من AE العازلة، 40 ميكرولترات من SDS، و 800 ميكرولترات من الفينول في درجة الحموضة منخفضة.
إعادة الاعتماد عن طريق دوامة لمدة 10 ثوان. ثم lyse الخلايا في التجانس لمدة ثلاثة رشقات نارية لمدة دقيقتين في أدنى إعداد الطاقة. اترك العينات على الجليد لمدة دقيقتين بين نبضات التجانس.
وضع الخلايا الليسين على الجليد الجاف لمدة خمس دقائق حتى يقوي. بعد ذلك، استخدم ميكروسنتريفروج لتدور الخلايا بسرعة أكثر من 13،000 مرات ز لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، قم بإجراء استخراج الكلوروفورم الفينول واستخراج الكلوروفورم كما هو موضح في بروتوكول النص.
إضافة ما بين 1/3 إلى 1/2 من حجم 10 كلوريد الليثيوم المولر ومزيج لترسب الجيش الملكي النيبالي. جهاز طرد مركزي بسرعة تزيد عن 13,000 مرة ز لمدة خمس دقائق. إزالة السائل، لفترة وجيزة إعادة تدور عينة لإزالة الدريغ.
ثم، وغسل بيليه مع 300 إلى 500 ميكرولتر من 70٪ الإيثانول. الطرد المركزي بيليه غسلها لفترة وجيزة، وإزالة أي الإيثانول المتبقية. إعادة حل بيليه RNA في 90 ميكرولترات من TE في درجة حرارة 7.0 عن طريق التدفئة في 65 درجة مئوية في حين تهتز.
بعد التحقق من solubilization RNA الكامل، نقل التعليق إلى أنبوب 0.2 ملليلتر. للبدء، biotinylate بإضافة 10 ميكرولترات من حل HPDP-البيوتين إلى الحمض النووي الريبي وخلطها جيدا. احتضان في الظلام في 65 درجة مئوية لمدة 15 إلى 30 دقيقة.
المقبل, إعداد حجم الراتنج الصغيرة, عمود استبعاد حجم لاستبعاد البيوتين غير مدمج. إزالة العلامة السفلية من العمود، وتخفيف الغطاء، ووضع العمود في أنبوب جهاز طرد مركزي ملليلتر اثنين. أجهزة الطرد المركزي في 1,500 مرات ز لمدة دقيقة واحدة لطرد العازلة وتجاهل تدفق من خلال.
ثم أضف بلطف 0.3 ملليلتر من TE إلى أعلى العمود وتدور مرة أخرى باستخدام نفس الشروط. نقل العمود غسلها إلى أنبوب 1.5 ملليلتر الطازجة. عند اكتمال عملية الحضانة، أضف العينة إلى أعلى العمود.
جهاز طرد مركزي في 1,500 مرات ز لمدة دقيقتين, ترك عينة الحمض النووي الريبي الحيوية في الجزء السفلي من الأنبوب. تجاهل العمود. وإضافة 1/3 إلى 1/2 حجم 10 كلوريد الليثيوم المولر إلى الأنبوب الذي يحتوي على العينة.
مزيج لإعادة العجلة الجيش الملكي النيبالي. أولاً، إعادة حل الحمض النووي الريبي في 200 ميكرولتر من المياه المعالجة DEPC. قياس تركيز RNA، وحساب الكميات لكل عينة من شأنها أن تعطي كميات متساوية من RNA لجميع العينات.
أضف هذه الكمية من الحمض النووي الريبي إلى أنبوب جديد، وأضف المياه المعالجة من DEPC مرة أخرى إلى حجم إجمالي قدره 200 ميكرولتر. عندما تكون العينة في درجة حرارة الغرفة، أضف 25 ميكرولترات من 10 × المخزن المؤقت NaTM، 25 ميكرولترات من فوسفات الصوديوم الضرس واحد، و 2.5 ميكرولترات من 10٪ SDS. اخلطي جيداً، والطرد المركزي برفق عند حوالي 100 مرة من الـ g لمدة تقل عن 30 ثانية.
إعداد مليلترين من العازلة حبة لكل عينة مع واحد X NaTM العازلة، 0.1 فوسفات الصوديوم الضرس، و 0.1٪SDS. إضافة 50 ميكرولترات من الخرز streptavidin إلى انخفاض الاحتفاظ أنبوب 1.5 ملليلتر. وضع أنبوب على رف المغناطيسي وانتظر الخرز لتسوية.
ثم، إزالة السائل عن طريق الطموح. لغسل الخرز، إضافة 200 ملليلتر من العازلة حبة ودوامة حتى يتم إعادة تعليق كامل بيليه حبة. جهاز طرد مركزي الأنبوب في حوالي 100 مرة ز لمدة أقصاها خمس ثوان.
ضع الأنبوب في الحامل المغناطيسي للسماح بالتقاط الخرز بواسطة المغناطيس. إزالة السائل عن طريق الطموح إذا كان هناك عدد قليل من العينات. صب قبالة السائل ومن ثم التعرق إذا كان هناك العديد من العينات.
كتلة مع 200 ميكرولترات من العازلة حبة، 10 ميكرولترات من الجليكوجين، و 2.5 ميكرولترات من الرنا. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة في حين أن نهاية الدورية على نهاية بسرعة معتدلة. بعد ذلك، قم بإزالة السائل واغسل مرة أخرى، كما هو موضح في بروتوكول النص.
إعادة تعليق الخرز في العينة، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة أثناء الدورية. خلال هذا الحضانة، وإعداد أنبوب 1.5 ملليلتر جديدة لكل عينة. إضافة 1/10 حجم من ثلاثة خلات الصوديوم الضرس في الأسي 5.3 و 20 ميكروغرام من الجليكوجين.
أجهزة الطرد المركزي في حوالي 100 مرة ز لمدة ثلاث ثوان. إزالة الجيش الملكي النيبالي غير من الخرز، وغسلها كما هو موضح في بروتوكول النص. لeeute الجيش الملكي النيبالي، إضافة 50 ميكرولترات من 0.7 الطازجة أعدت بيتا mercaptoethanol إلى الخرز.
بعد الدوامة والطرد المركزي، ضع الطين في الحامل المغناطيسي. Pipette الحمض النووي الريبي التي تحتوي على حل في أجهزة الطرد المركزي 1.5 milliliter أعدت. Elute مرة أخرى كما وصف سابقا.
ثم، ضع العينة مرة أخرى في الحامل المغناطيسي لإزالة الخرز المتبقي من الحمض النووي الريبي المائل ونقل السائل إلى أنبوب طرد مركزي جديد منخفض الربط 0.5 ملليلتر. اخلطي العينة. ثم إضافة 2.5 مجلدات من الإيثانول لترسب ن سرنا.
بعد خلط واحتضان، والطرد المركزي بسرعة لا تقل عن 13،000 مرات ز و4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. يتم عرض الغلة النموذجية لsnRNA استردادها باستخدام هذا البروتوكول هنا. لاحظ أن استعادة RNA في الوقت نقطة الصفر هو جزء صغير جدا من أن تعافى من نقاط زمنية أطول مع 0.3 ميكروغرام فقط من RNA يجري استردادها من الخلايا حوالي 30 مليار.
بعد 30 ثانية فقط من وضع العلامات ، ومع ذلك ، يتم جمع أكثر من ضعف الحمض النووي الريبي من نفس العدد من الخلايا. في أثر تحليل حيوي، يمكن رؤية سلائفنا الحمض النووي الريبي على أنها قمة قريبة من 1000 نوكليوتيدات ومضاعفة من القمم في 1، 700 إلى 1، 800 نيوكليوتيدات. وتزداد وفرة هذه الوسيطات مع استمرار التصبغ.
ثم يتم تنفيذ ثيوليشن مع عينات يجري أخذها في 15 فواصل ثانية من بداية وضع العلامات thio ويتم رصد معالجة ACT1 RNA نسخة. كما يمكن أن ينظر إليه قبل مرنا و lariats يتم إنشاؤها حتى بعد 15 ثانية فقط من وضع العلامات. بعد حوالي 45 ثانية إلى دقيقة واحدة، وكمية من لاريات وما قبل مرنا التوصل إلى التوازن مع أكبر قدر من هذه الأنواع الحمض النووي الريبي التي يتم إنشاؤها عن طريق النسخ كما تتم معالجتها بعيدا عن طريق الربط.
والخطوات الأكثر صعوبة هي تلك التي تنطوي على الخرز، وغسل، والحجب. يجب الحرص على عدم فقدان الخرز، أو السماح لهم تجف. مرة واحدة لديك تنقية RNA توليفها حديثا، يمكنك استخدام أي إجراء تحليل الحمض النووي الريبي التقليدية.
من المستحسن أن تقوم بتشغيل RNA على محلل حيوي أو ما شابه ذلك. بعد ذلك، ونحن عادة استخدام QPCR والرنا-SEQ لتحليل الجيش الملكي النيبالي. أثبتت هذه الطريقة مثالية لتحليل حركية معالجة الحمض النووي الريبي.
الخطوات الأكثر خطورة هي تلك التي تستخدم الفينول والكلوروفورم في استخراج الحمض النووي الريبي. في أي وقت يمكنك استخدام هذه المواد الكيميائية في حاوية غير محكم، القيام بذلك في غطاء الدخان، وارتداء الملابس الواقية المناسبة، ومعطف مختبر، والقفازات. خذ عناية خاصة أن هناك لا حبات الزركونيا في الخيط من أنبوب غطاء المسمار، لأن ذلك سيؤدي إلى تسرب.
