الحمض النووي والرنا microarrays مفيدة جدا لدراسة التفاعلات بين الأحماض النووية والبروتينات، لكنها أيضا وسيلة مريحة لإعداد مكتبات التسلسل. يسمح التصوير الضوئي لمئات الآلاف من تسلسل فريدة من نوعها ليتم توليفها بالتوازي، وحاليا الطريقة المباشرة الوحيدة لتوليف الحمض النووي الريبي على microarrays. ويمكن أيضا توسيع التوليفة الفلوتولوجية في الموقع من microarrays إلى oligonucleotides المعدلة كيميائيا، على سبيل المثال مع اثنين من الفلورو الرئيسي من الأحماض النووية الببتيد.
رؤية عملية تصنيع microarray والتعامل معها يمكن أن تساعد على فهم كيفية تطوير هذه الآلية المعقدة من المعروف جيدا تركيب الحمض النووي المرحلة الصلبة القياسية. ابدأ هذا الإجراء بتصميم microarray ووظيفية الشريحة كما هو موضح في بروتوكول النص. بدوره على الحمض النووي المزج الأشعة فوق البنفسجية LED ومروحة التبريد.
نعلق على قياس كثافة الأشعة فوق البنفسجية في نقطة محورية للأشعة فوق البنفسجية واردة وتشغيله. على الكمبيوتر، ابدأ تشغيل برنامج تحكم WiCell. تشغيل جهاز micromere و تهيئةه.
تحميل ملف قناع أبيض كل عن طريق النقر على حق DMD ومن ثم تحديد صورة التحميل. انقر بزر الماوس الأيمن على أيقونة UVS وحدد فتح مصراع الأشعة فوق البنفسجية. قراءة قيمة الطاقة على مقياس شدة والعد 60 ثانية.
بعد 60 ثانية، اقرأ قيمة الطاقة مرة أخرى ولاحظ قيم البداية والنهاية. أغلق الغالق عن طريق تحديد إغلاق مصراع الأشعة فوق البنفسجية وإيقاف تشغيل مقياس الكثافة. حساب متوسط قيمة كثافة الأشعة فوق البنفسجية في ميلي واط لكل سنتيمتر مربع.
في برنامج WiCell ، قم بتحميل ملفات المهمة والتسلسل والبروتوكول في الإطارات الفرعية الخاصة بها ، ثم انقر فوق إرسال لإرسال ملفات التسلسل والبروتوكول إلى المزج للحمض النووي. لتجميع خلية التوليف مكان سميكة البيرفلورورايلاستمر طوقا على كتلة الكوارتز من الخلية. ثم ضع شريحة مجهر مثقبة وظيفية فوق طوقا الأول، وتحقق من أن الثقوب على الشرائح تتصل بمدخل ومخرج أنابيب الخلية التوليفية.
ضع طوقاً ثانيًا ورفيقًا متعددtetrafluoroethylene فوق الشريحة المحفورة ، المحيطة بالثقوبتين. وأخيرا، ضع شريحة ثانية، وظيفية ولكن غير مفككة فوق طوقا الثاني. الآن وضع إطار معدني 4-المسمار على رأس تجميعها خلية مزدوجة الركيزة تشديد المسمار إلى نفس قوة لقط باستخدام مفك عزم الدوران.
إرفاق مدخل ومأخذ أنابيب إلى المزج الحمض النووي. رئيس خط غسل الأسيتونتريle والتحقق من تدفق السليم من الأسيتونيتريل من خلال ركائز. قياس حجم الأسيتونيتريل في خط النفايات بعد الذهاب من خلال سبع دورات من فتيلة الأسيتونيتريل.
يجب أن يكون حجم التخزين هذا ملليلترين. إرفاق خلية التوليف في الطائرة البؤرية للضوء الواردة للأشعة فوق البنفسجية. في حالة إعداد المكتبة، قم بإرفاق مدخل إضافي وخط مخرج إضافي إلى الجزء الخلفي من الخلية وملء الغرفة الخلفية بمليلترين من محلول بيتاكاروتيني.
بدء التوليف عن طريق النقر أولاً على تشغيل في برنامج WiCell. في أول أمر الانتظار في ملف الوظيفة، اضغط على مفتاح المزج للحمض النووي. بعد تركيب microarrays العادية، قطع الخلية من المزج، وتفكيك الخلية.
استخدام قلم الماس لحفر رقم التوليف على الشرائح الزجاجية. حفر الرقم على وجه غير توليفية من كل شريحة. نقل الشرائح إلى أنابيب أجهزة الطرد المركزي 50 ملليلتر وتخزينها في منطقة المجففة حتى مزيد من الاستخدام.
بعد تركيب microarrays المكتبة، أولا استنزاف حل بيتاكاروتين من الغرفة ثم غسل الغرفة مرتين عن طريق تدفق خمسة ملليلتر من كلوريد الميثيلين من خلال قبل استنزاف. بالنسبة لإزالة البروتيتيكشن من الحمض النووي النووي، املأ جرة زجاجية ملطخة بـ 20 ملليلتر من الإيثانول و20 ملليلتر من EDA. ضع الـ DNA-only microarrays عموديًا في الجرة، واغلق الغطاء، واترك الشرائح لإلغاء الحماية لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة.
بعد ساعتين، استرداد الشرائح باستخدام ملاقط وشطفها جيدا بالماء المقطر المزدوج. جفف الشرائح في جهاز طرد مركزي صغير لبضع ثوان قبل تخزينها في جهاز تجفيف. بالنسبة للحمض النووي الريبي الصغير، قم بإعداد محلول جاف من ثلاثي الإيثيلامين 20 ملليلتر و30 ملليلتر أسيتونتريريل في أنبوب طرد مركزي 50 ملليلتر.
نقل شريحة صغيرة RNA واحد في أنبوب الطرد المركزي، وإغلاق الغطاء والتفاف مع فيلم الختم البلاستيك. هز أنبوب الطرد المركزي بلطف على شاكر مداري لمدة ساعة و30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، قم بإزالة الشريحة واغسل مرتين بـ 20 ملليلتر من الأسيتونتريل الجاف قبل التجفيف في جهاز طرد مركزي صغير لبضع ثوان.
بعد الخطوة الأولى إزالة الحماية نقل شريحة RNA في حل هيدرات hydrazine، أغلق الغطاء والتفاف مع فيلم ختم البلاستيك. بعد ساعتين من الاهتزاز بلطف على شاكر المدارية، وإزالة الشريحة وغسلها مرتين مع 20 ملليلتر من الأسيتونيتريل الجاف. ثم يجف في جهاز طرد مركزي صغير لبضع ثوان.
إذا كان الحمض النووي الريبي يحتوي أيضا على نيوكليوتيدات الحمض النووي، والمضي قدما مع خطوة إزالة الحماية الثالثة. إضافة الحمض النووي / الحمض النووي الريبي microarray إلى أنبوب 50 ملليلتر تحتوي على واحد إلى واحد EDA-الإيثانول حل بعد 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وإزالة الشريحة، وغسل microarray مرتين مع 20 ملليلتر من الماء المعقم. جفف الشريحة في جهاز طرد مركزي صغير ومخزن في مجفف.
في أنبوب 1.5 ملليلتر معقم microcentuge، وإعداد العازلة التهجين التي تحتوي على الحمض النووي Cy3- labelled، كما هو موضح في بروتوكول النص. مزيج ودوامة الحل. ضع بعناية غرفة تهجين 300 ميكرولتر ذاتية اللصق فوق منطقة التوليف على كل شريحة و pipet في حل التهجين.
تغطية ثقوب الغرفة مع النقاط لاصقة والتفاف الشريحة بأكملها في رقائق الألومنيوم. ضع الشريحة الصغيرة في فرن التهجين، واغطيها واتركها تدور بلطف في درجة حرارة التهجين المحددة لمدة ساعتين. بعد ساعتين، فصل الشريحة، وإزالة رقائق الألومنيوم، ماصة من حل التهجين، وتمزيق بعناية قبالة غرفة التهجين.
نقل الشرائح إلى أنبوب الطرد المركزي التي تحتوي على 30 ملليلتر من العازلة غسل غير صارمة. يهز بقوة لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. نقل الشريحة إلى أنبوب الطرد المركزي التي تحتوي على 30 ملليلتر من العازلة غسل صارمة ويهز بقوة لمدة دقيقة واحدة.
وأخيراً، قم بنقل الشريحة إلى أنبوب طرد مركزي يحتوي على 30 ملليلتر من عازلة الغسيل النهائية. اهتز لبضع ثوانٍ جفف الشريحة في جهاز طرد مركزي صغير.
الآن، ضع microarray الجافة، منطقة التوليف التي تواجه لأسفل، في حامل الشريحة من الماسح الضوئي microarray. لفك الحماية وشق مكتبات الحمض النووي، غمر الشريحة في حل الانقسام، في أنبوب طرد مركزي 50 ملليلتر. أغلق الأنبوب ولف بفلاش بلاستيكي، قبل أن يتناوب بلطف في شاكر مداري لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة.
بعد ساعتين، وإزالة الشريحة وغسل مرتين مع 20 ملليلتر من الأسيتونيتريلي الجافة بدقة قبل السماح لها الهواء الجاف. مع ماصة، وتطبيق 100 ميكرولترات من المياه المعقمة على منطقة التوليف الآن ملحوظ. Pipet الحل صعودا وهبوطا عدة مرات قبل نقله إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 ملليلتر.
كرر العملية والجمع بين الوميكروراي في نفس الأنبوب. يتبخر رقاقة مُلَح إلى جفاف ومن ثم إعادة الذوبان إلى 10 ميكرولترات من H2O خالية من النوى. تظهر هنا نتائج فحص التهجين الذي يتم تنفيذه على microarray يحتوي على إصدارات الحمض النووي والرنا من تسلسل 25mer.
ويظهر المسح الضوئي في شكل تدرج أخضر يقابل الإثارة، وطيف الانبعاثات من Cy3 fluorescence، مع كثافة الفلوريس سجلت في وحدات تعسفية. هناك تباين كبير في قيم الفلورانس المطلقة بين التجارب. تظهر نتائج ثلاثة syntheses مستقلة باستخدام نفس المعلمات تلفيق ومعالجة ما بعد الاصطناعية نفسه.
الحمض النووي 25mer، عندما هجين إلى حبلا الحمض النووي التكميلية Cy3 المسمى، سوف تسفر عن إشارات الفلورنس تتراوح بين 20، 000 إلى 30،000، نادرا جدا فوق أو أقل. و 25mer RNA، عندما هجين إلى نفس تكملة الحمض النووي Cy3 المسمى، وسوف تعطي كثافة الفلوريسنس على الميزات المقابلة التي تتراوح بين 15، 000 إلى 20، 000. ومع ذلك، فإن كثافة الفلور من الدوبلوجات الحمض النووي/الحمض النووي تنخفض أحيانًا إلى أقل من 8000، عندما تظل الدوبليكس المزدوجة للحمض النووي/الحمض النووي المقابلة في نطاق 20، 000 إلى 30، 000.
وفي مثل هذه الحالات، يمكن اعتبار نتائج الحمض النووي الريبي دون المستوى الأمثل. كما هو الحال مع أي تجربة أخرى تستند إلى الحمض النووي الريبي من المهم أن نتذكر أن الحمض النووي الريبي microarrays حساسة للتدهور، وينبغي التعامل معها في ظل ظروف معقمة. يمكن استخدام مكتبات الحمض النووي التي يتم جمعها من microarrays في تسلسل الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي وكذلك في ترميز المعلومات الرقمية على الحمض النووي.
ينتج NED ضوءًا للأشعة فوق البنفسجية المكثفة التي لا ينبغي النظر إليها مباشرة. وبسبب هذا ، ينصح بارتداء نظارات واقية أثناء استخدام الأداة.
