المسبار المستخدمة على نطاق واسع CFDA، أو قصيرة لsdiacetate carboxyfluorescein، غير فلورية. المجموعتين H3 وموقف 3'6'على هذا المركب جعله غشاء permeant. حيث مرة واحدة داخل الخلايا، خلات الخلوية الداخلية سوف إزالة مجموعات خلات والإفراج عن شكل جديد من CFDA.
هذا هو carboxyfluorescein ، أو CF ، وهو الفلورسنت. ولأن هذا الشكل الجديد هو أقل غشاء permeant، والوزن، وجميع الخلايا هو التحرك من خلال المسام بين الخلايا، أو plasmodesmata في النباتات، وهذا يجعل هذا diacetate التحقيق المثالي لدراسة النقل بين الخلايا في نشاط الفليم. في فيديو اليوم، سنقوم بإثبات تحميل CFD في جذر و نقصcotyl من النباتات Arabidopsis على التوالي، وسوف نظهر كيف اثنين من الإجراءات المختلفة قليلا سوف تؤثر على أسفل إلى أعلى حركة هذا المسبار الفلورسنت.
تحقيق نتائج تلطيخ باستمرار، ونحن تخزين بذور Arabidopsis حصادها في أربع درجة مئوية، 40٪ مجلس الوزراء الرطوبة. وتستخدم البذور التي تم حصادها حديثا في هذه الحالة لأكثر من سبعة أيام بسهولة لبذر. لضمان زراعة كل مصنع في مساحة مماثلة نسبيا في طبق بيتري، ونحن نستخدم بطاقة درجة منطقة البذور.
الآن، ترطيب طرف تعقيم، تراجع في البذور تعقيم، وزرع البذور واحدا تلو الآخر على الموقف المعين. بعد الانتهاء من البذر، ختم طبق بيتري مع البارا فيلم وشريط لزجة، ووضعها على موقف طبق بيتري للسماح لها تنمو عموديا. هنا هي الأدوات التي نحن ذاهبون لاستخدامها في هذه التجربة.
يرجى ملاحظة أننا أفضل تحميل الصبغة بأسرع ما يمكن. عادة، يمكنك الانتهاء من العملية برمتها في 10 إلى 15 دقيقة. قبل أن نقوم بتجربة تحميل CFDA، نقوم دائمًا بإعداد حل CFDA جديد.
هنا، تمييع CFDA المليمولار واحد إلى خمسة تركيزات ميكرومولار مع الماء قبل الاستخدام الفوري. قطع parafilm إلى قطع صغيرة في ثلاثة في ثلاثة ملليمتر الحجم. لأن هناك تكثيف على غطاء وأسفل طبق بيتري، ونحن بحاجة إلى مسح بها مع منشفة ورقية لتجنب صبغ تتدفق حولها.
يتم وضع قطعة صغيرة من البارا فيلم تحت الجذر. رفع النباتات ووضعها على الغطاء. قطع الجذور حوالي خمسة إلى 10 ملليمتر تحت المهيبوكول.
خذ يطلق النار مرة أخرى على قطعة صغيرة من البارا فيلم. الآن تطبيق بعناية CFDA ميكرولتر واحد على نهاية القطع من الجذر. في محاولة لتجنب تلويث جميع النباتات بروتو.
ثم تغطية الغطاء، ثم تركها في غرفة النمو لمدة ساعتين. طريقة هيبوكو تيل معسرة. يتم وضع قطعة البارا فيلم الصغيرة ، كما تم إعدادها مسبقًا ، تحت تقاطع الـ root-hypocotyl.
نستخدم a forecep إلى بلطف قرصة hypocotyl قريبة من أنسجة الجذر، وتطبيق بعناية 0.1 microliter CFDA على الجانب مقروص وترك النبات لمدة ساعتين. الصور من تسعة إلى 12 يوما بعد منطقة تلطيخ النباتات. أنها تظهر جميع نمط تلطيخ الأوعية الدموية في كل من كوتيليفدون والأوراق الحقيقية.
فقط في حالة نادرة جدا، وأظهرت ورقة كوتيليدون نمط تلطيخ نصف ورقة. حتى في الأساس ، لم اثنين من الطرق لا تحدث فرقا في نمط تلطيخ CF ، ولكن إذا كنا تنفيذ صبغ التحميل في المزيد والمزيد من النباتات ، نجد اثنين من الإجراءات تعطي صفقة فرق كبير في الكفاءة. مع طريقة قطع الجذر، حوالي 70٪ من النباتات تظهر إشارة الفلورسنت في تبادل لاطلاق النار.
ولكن يمكن زيادة الكفاءة إلى 91٪ باستخدام طريقة نقصcotyl معسر. حاولنا أيضا طريقة معسر الجذر، ولكن هذه الطريقة تؤدي إلى انخفاض الكفاءة، انها حوالي 30٪ ولذلك، يبدو أن طريقة لتحميل صبغة لا يفسر الفرق تلطيخ. والفرق يكمن على الأرجح في مواقع التحميل، التي قد تكون مفصولة بحاجز تكافلي.
أظهرنا كيف نقوم بتحميل CFDA في جذور Arabidopsis و hypocotyl. استخدمنا اثنين من الإجراءات المختلفة قليلاً، وهاذين الإجراءين مختلفة قليلاً يؤدي إلى اختلاف كبير في هذا الجزء السفلي إلى أعلى حركة التحقيق. نقترح أن هذه الطريقة يمكن أن تساعدنا على تحديد حاجز symplastic المحتملة لإشارات تبادل لاطلاق النار المستمدة من الجذر.
