يوفر هذا البروتوكول منصة لدراسة استجابات خلايا CD4T التي تكون ضعيفة في كثير من الأحيان ويصعب اكتشافها. يسمح هذا الأسلوب للكشف عن تعداد وعزل خلايا CD4T دون معرفة مسبقة فيما يتعلق بالعرض antigen. الميزة الرئيسية هي تحليل خلايا CD4T التي غالبا ما تكون مجموعات نادرة المرتبطة بالظروف المناعة الذاتية مثل مرض السكري من النوع الأول.
عند الحصول على عينة الدم المحيطية من متبرع سليم ، تمييع الدم في PBS بنسبة واحدة إلى اثنتين على الأقل قبل طبقات 35 ملليلتر من الدم أكثر من 15 ملليلتر من متوسط الكثافة الانحدارية في أنبوب 50 ملليلتر. فصل الخلايا بواسطة الطرد المركزي التدرج الكثافة وإزالة ما يقرب من 20 ملليلتر من طبقة البلازما العليا الناتجة. ثم جمع طبقة خلايا الدم البيضاء مع الحرص على تجنب بيليه خلية الدم الحمراء وغسل الخلايا ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني جديد.
بعد العد، تمييع الخلايا إلى مرة واحدة 10 إلى الخلايا أحادية النوى الدموية الطرفية السادسة أو PBMC لكل ملليلتر من تركيز PBS. إضافة 300 ميكرولترات من الخلايا لكل عنصر تحكم في أنابيب 10 ملليلتر الفردية. بعد تتصدر كل أنبوب مع برنامج تلفزيوني، رواسب الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق الخلايا في مرة واحدة 10 إلى الخلايا السادسة لكل ملليلتر من تركيز RP5 المتوسطة.
ثم لوحة 100 ميكرولترات من الخلايا لكل عنصر تحكم إلى كل من ثلاثة آبار من 96 لوحة بئر تحتوي على 100 ميكرولترات من RP5 المتوسطة في البئر. ضع اللوحة في حاضنة ثقافة الخلية لمدة سبعة أيام. بعد ذلك، نقل PBMCs المتبقية إلى أنبوب جديد 50 ملليلتر وإضافة ميكرولتر واحد من حل المخزون العامل CFSE لكل ملليلتر من تعليق الخلية إلى جانب الأنبوب.
عكس الأنبوب بسرعة عدة مرات لخلط الخلايا ووضعها في حاضنة ثقافة الخلية لمدة خمس دقائق. في نهاية الحضانة ، قم باعتقال التفاعل مع خمسة ملليلترات من RP5 المتوسطة وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. Resuspend بيليه في مرة واحدة 10 إلى PBMCs السادسة لكل ملليلتر من RP5 المتوسطة الطازجة وإضافة ملليلتر واحد من الخلايا إلى أنبوب واحد 10 ملليلتر لكل مستضد ليتم اختبارها.
ثم إضافة 100 ميكرولترات من الخلايا لكل مستضد إلى كل من ثلاثة آبار من 96 بئر لوحة جيدا تحتوي على 100 ميكرولترات من RP5 المتوسطة تكملها مستضد مخفف من الفائدة في البئر. ضع اللوحة في حاضنة ثقافة الخلية لمدة سبعة أيام. لطخة مجموعات الخلايا CD4 + T لتحليل تدفق السيتوميترية، في نهاية الثقافة نقل كامل حجم الخلايا من كل بئر إلى الخلايا الفلورية تنشيط الفردية أو أنابيب FACS.
غسل كل عينة مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني تكملها 0.1٪ مصل العجل الجنين أو FCS. Resuspend الكريات في المضادة المضادة المضادة للدم البشري مناسبة في 100 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني زائد FCS لكل أنبوب. احتضان الخلايا في أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة محمية من الضوء.
في نهاية الحضانة، وغسل العينات في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني جديد بالإضافة إلى FCS لكل أنبوب وإعادة تثبيت الكريات في 100 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني جديد بالإضافة إلى FCS. مباشرة قبل التحليل، إضافة ميكرولتر واحد من يوديد بروبديسيوم إلى كل أنبوب للسماح باستبعاد الخلايا الميتة. بوابة الخلايا الليمفاوية وفقا لمناطقها إلى الأمام والجانبية مبعثر.
لاستبعاد الخلايا المبرمجة، بوابة منطقة التشتت الأمامية مقابل الخلايا السالبة لـ propidium iodide واستخدام الخلايا غير المُطَمَّعة لتعيين خط أساس جهد لخلايا غير فلورية. تعيين الفولتية لD4 الفلوروفور الأجسام المضادة وإشارة CFSE بحيث إشارة الفلورسنت هو أقل من 1000 لكل. استخدام التحكم اللون واحد CFSE وعينات CD4 لتأكيد إشارة الفلورسنت إيجابية لكل لون باستخدام الفولتية تعيين مع الخلايا غير الملطخة.
كما CFSE وأوديد بروبيديوم بعض التداخل الطيفي، وضبط التعويض لطرح الفلوري يوديد بروبديوم من الفلورسينسي CFSE حتى العينة فقط CFSE لا تسفر عن إشارة في قناة يوديد بروبديدوم. عندما تم تحليل كافة العينات، حساب مؤشر تقسيم الخلية عن طريق قسمة عدد الخلايا المقسمة على 5000 الخلايا غير المقسمة من مجموعة مستضد حفزها من قبل متوسط عدد الخلايا المقسمة لكل 5000 الخلايا غير المقسمة من الخلايا المستنم دون مستضد. تقريبا جميع المتبرعين تظهر قوية T-الخلية استجابة لتيتانوس toxoid بعد تحفيز في المختبر لأن المتبرعين قد تم تطعيم مما يجعل الكزاز توكوكسيد مكافحة إيجابية مفيدة.
ومع ذلك، فإن انتشار خلايا CD4+T من مراكز PBMCs غير المُحَرَّخة هو الحد الأدنى. بعد سبعة أيام من التحفيز مع الإنسان الموالية للأنسولين C-الببتيد, الموالية للأنسولين C-الببتيد محددة CD4 + T يمكن الكشف عن خلايا في الدم المحيطي للفرد مع نوع واحد من مرض السكري. PBMC حفز مع الأنفلونزا A بروتين مصفوفة الفيروس تثبت أيضا الانتشار.
معا، وهذه البيانات تثبت أن يمكن إجراء مقايسة باستخدام البروتينات طول كامل فضلا عن الببتيدات الاصطناعية قصيرة. يمكن تنفيذ مكون FACS من هذه الطريقة باستخدام جهاز قياس تدفق الخلايا لفرز الخلايا. باستخدام فارز خلية، يمكن عزل الخلايا التائية الخاصة بمضادات المضادات على مستوى الخلية المفردة لتحليل المصب.
وقد سمحت هذه الطريقة لاكتشاف استجابات الخلايا CD4T في الأفراد الذين يعانون من مرض السكري من النوع الأول في بداية مبكرة. تحليل هذه النادرة T-الخلية السكان باستخدام أساليب أخرى يطرح تحديات تقنية مختلفة.
