وقد ثبت جيدا أن هياكل العديد من البروتينات استقرت في وصلات ثاني كبريتيد التساهم. وقد صنفت هذه السندات في العمل الأخير على أنها تعديل ما بعد الترجمة. وبالتالي، من المهم أن تكون قادرة على تحديد مجمعات متعددة مستقرة السيستين في الخلايا الحية باستخدام طريقة سريعة وبسيطة.
والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن الحصول على النتائج وتفسيرها بسرعة وسهولة وبأدنى تكلفة. للبدء، تنمو خلايا OS U-2 في طبق ستة سنتيمتر مربع في الحد الأدنى من الجلوكوز المتوسطة المتوسطة الأساسية، وتستكمل مع 10٪ FBS و 1٪ بيروفات الصوديوم في 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون. جعل مخزون جديد من 10 ميلليمولار iodoacetamide قبل الاستخدام.
بعد الخلايا تصل إلى 50 إلى 60٪ التقاء, إضافة 0.1 ميليمولار التركيز النهائي iodoacetamide مباشرة إلى وسائل الإعلام ثقافة الخلية. صخرة بلطف الطبق في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين. المقبل، الاستنشاق وسائل الإعلام من الخلايا، وغسل الخلايا مع خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني الباردة ثلاث مرات.
استلهم محلول غسل PBS النهائي ، وإضافة ملليلتر واحد من PBS البارد. كشط الخلايا قبالة الجزء السفلي من الطبق باستخدام مكشطة الخلية. باستخدام ماصة ملليلتر واحد رسم برنامج تلفزيوني وتعليق الخلية والاستغناء عن جميع السائل في أنبوب microcentuge 1.5 ملليلتر.
تدور الخلايا في 7, 500 مرات ز في أربع درجات مئوية لمدة ثلاث دقائق. الطامح برنامج تلفزيوني ترك بيليه الخلية وراء. ويمكن تخزين بيليه الخلية في ناقص 80 درجة مئوية حتى المعالجة.
لاستخراج البروتين، وإعداد 100 ميكرولترات من عازلة تحلل 1X المخفف في الماء المقطر مزدوجة. إضافة PMSF مباشرة قبل استخدامها إلى تركيز نهائي واحد ملليمولار. ثم إضافة 50 ميكرولترات من 1X تحلل العازلة مباشرة إلى بيليه الخلية وإعادة تعليق.
احتضان استخراج على الجليد لمدة خمس دقائق. Sonicate لمدة ثماني ثوان باستخدام وضع نبض ثابت في 40٪ حفظ استخراج على الجليد. تدور استخراج في أربع درجات مئوية و 16،000 مرات ز لمدة خمس دقائق.
إجراء تحليل برادفورد لتحديد تركيز البروتين إذا رغبت في ذلك. لإعداد العينة تأخذ 10 ميكرولترات من مستخلص البروتين القابل للذوبان وإضافة 10 ميكرولترات من 1X Laemmli SDS عينة المخزن المؤقت. إبقاء العينات على الجليد.
سخني العينة على حرارة 85 درجة مئوية لمدة خمس دقائق قبل تشغيل الجل. لبدء ربط الفورمالديهايد عبر، تنمو خلايا نظام التشغيل U-2 في قارورة 175 سم مربع إلى 70 إلى 80٪ التقاء. في غطاء محرك الدخان إضافة الفورمالديهايد تثبيت مباشرة إلى متوسطة إلى تركيز النهائي من 1٪، واحتضان في درجة حرارة الغرفة مع التحريض لطيف لمدة 15 دقيقة.
لإخماد رد الفعل إضافة 1.25 جليسين المول إلى تركيز نهائي من 0.125 الضرس واحتضان في درجة حرارة الغرفة مع التحريض لطيف على الروك لمدة خمس دقائق. غسل الخلايا مع خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني الباردة ثلاث مرات. pirate النهائي برنامج تلفزيوني غسل الحل وإضافة 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني.
كشط الخلايا من أسفل القارورة باستخدام مكشطة خلية. باستخدام ماصة 10 ملليلتر رسم برنامج تلفزيوني وتعليق الخلية وصرف كل من السائل في أنبوب أجهزة الطرد المركزي المخروطية 15 ملليلتر. تدور الخلايا في 500 مرة ز وأربع درجات مئوية لمدة دقيقتين.
الطامح برنامج تلفزيوني ترك بيليه الخلية وراء. إعداد 10 ملليلتر من العازلة التجانس بإضافة 0.25 الزروس الضروس, واحد ملليمولار EDTA, 10 ملليمتر HEPES و 0.5٪ BSA في pH 7.4. مباشرة قبل الاستخدام، إضافة PMSF إلى تركيز نهائي واحد ملليمولار وثلاثة ملليلترات من العازلة تعليق نوات.
إضافة خمسة ملليلتر من العازلة التجانس مباشرة إلى بيليه الخلية وإعادة الاعتماد تماما. الطرد المركزي تعليق في 500 مرة ز و 4 درجات مئوية لمدة دقيقتين. بعد الطرد المركزي، والتخلص من عظمى وإعادة تعليق بيليه في خمسة ملليلتر من العازلة التجانس.
ثم مع ضيق الزجاج تركيب التفلون التجانس dounce تجانس الخلايا في 10 السكتات الدماغية لكل 500 دورة في الدقيقة والطرد المركزي تعليق في 1، 500 مرات ز وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. بعد الطرد المركزي تجاهل المابير. Resuspend بيليه في ملليلتر واحد من العازلة تعليق nuclei واحتضان على الجليد لمدة 10 دقائق.
بعد الحضانة، الطرد المركزي في 600 مرة ز لمدة 10 دقائق. بعد الطرد المركزي، والتخلص من السوبر، resuspend بيليه في ملليلتر واحد من العازلة تعليق نوات والطرد المركزي مرة أخرى. ستكون الكريه الأخيرة هي النوى المعزولة.
استخراج البروتينات كما هو موضح قبل إضافة 25 ميكرولترات من 1X تحلل العازلة مباشرة إلى بيليه الخلية. ثم إعداد عينتين لSDS PAGE عن طريق اتخاذ 10 ميكرولتررز كل من استخراج البروتين القابل للذوبان وإضافة 10 ميكرولترات من 2X Laemmli SDS عينة العازلة وميكرلترات واحدة من BME. سخني عينة واحدة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق والعينة الثانية عند 98 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لعكس وصلة الفورمالديهايد.
إعداد لتر واحد من 1X تريس-جليكاين تشغيل العازلة عن طريق خلط 25 ملليمولار تريس, 192 غليسين ميليمولار و 0.1٪ الوزن لكل حجم SD. ثم قم بإعداد جهاز تشغيل صفحة SDS. افتح حزمة TGX SDS-PAGE بنسبة 16٪ ثم قم بإزالة الكاسيت. إزالة المشط الذي بطانة الآبار والشريط من الجزء السفلي من الكاسيت ووضع هلام في جهاز تشغيل.
ملء الغرفة مع 1X تشغيل العازلة حتى يتم غمر الآبار في السائل. باستخدام ماصة بلاستيكية شطف الآبار مع تشغيل العازلة. تحميل العينات على هلام جنبا إلى جنب مع 10 ميكرولترات من علامة القياسية قبل الملون.
وأخيراً، قم بتشغيل الجل عند 200 فولت حتى تصبح جبهة الصبغة سنتيمترًا واحدًا تقريبًا من أسفل الجل. وأظهر تحليل لطخة غربية من مجموع مقتطفات الخلية في غياب عامل الحد BME تشكيل معقدة متعددة اميرك في مجموعات الخلايا البشرية المختلفة. اختفى المجمع مع إضافة BME في جميع خطوط الخلايا الأربعة التي تم فحصها، مما يشير إلى وجود وصلة من ثنائي الكبريتيد.
إن تأكيد الدوتباس في الخلايا البشرية في وقت الحصاد هو مزيج من ثلاثة على الأقل من الأشكال الأيزوفورم dUTPase: isoform الميتوكوندريا، isoform النووية، ونسخة مبتورة لوحظ في M24. لم يشكل الشكل الأيزوفورم الميتوكوندريا المستخدم كتحكم رابطاً للفكيتيد وهاجر إلى الوزن الجزيئي المتوقع للبروتين أحادي اللون. الفورمالديهايد عبر ربط dUTPase النووية أظهرت تشكيل مجمع متعدد اًميريات.
وعندما انعكست الوصلة المتقاطعة عن طريق احتضان العينة عند 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، تزعزع استقرار المجمع ويمكن تصوره في حالته أحادية الولاية. إضافة iodoacetamide هو خطوة هامة في هذا الإجراء لمنع بقايا السيستين الحرة وضمان أن الروابط كبريتيد ليست نتيجة لإجراء الاستخراج. من المهم أن نتذكر عدم إضافة أي عامل تقليل، مثل BME أو دي دي تي إلى عينات SDS-PAGE الخاصة بك لأن هذه سوف تقلل من أي روابط من حيث الكبريتيد الموجودة في العينة الخاصة بك.
