هذا البروتوكول يتيح التصور من عدوى الفيروس ويوفر رؤى عميقة في القرار ازن الزمني من بيئة العدوى والسياق الخلوي المحيط بها. تطبيق المناعة على التصوير الأنسجة العميقة لا يسمح فقط الكشف عن الفيروسات، ولكن في الواقع أيضا تمكن من التفريق بين مختلف الاكتظاظ الخلوي باستخدام علامات الخلية الخاصة بهم. لإصلاح الأنسجة للمناعة مكان عينات الدماغ في نسبة واحد إلى 10 من 4٪ شبهformaldehyde في برنامج تلفزيوني لعينة من حجم الأنسجة لمدة 48 ساعة على الأقل في أربع درجات مئوية.
في نهاية فترة التثبيت غسل عينات الأنسجة ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة على الأقل لكل غسل قبل نقل العينات إلى 02٪ أزيد الصوديوم في برنامج تلفزيوني في أربع درجات مئوية. ثم استخدم مجموعة اهتزازية إلى 0.3 إلى 0.5 ملليمتر في الثانية معدل تغذية شفرة لقسم الأنسجة إلى أقسام سميكة ملليمتر واحد. تخزين الأقسام في أزيد صوديوم 02٪ الطازجة في برنامج تلفزيوني في أربع درجات مئوية.
للمعالجة المسبقة الميثانول تزج العينات في سلسلة الميثانول التصاعدي كما هو مبين لمدة ساعة واحدة لكل حضانة في درجة حرارة الغرفة مع تذبذب لطيف. بعد الحضانة الأخيرة تبرد العينات إلى أربع درجات مئوية. استبدل الميثانول بنسبة 100٪، بأربعة ملليلترات من محلول التبييض المبردة مسبقاً لاحتضان لمدة ليلة واحدة عند أربع درجات مئوية.
في صباح اليوم التالي استبدال حل التبييض مع أربعة ملليلتر من الميثانول 80٪ الطازجة لمدة ساعة واحدة حضانة في درجة حرارة الغرفة. ثم تزج العينات في سلسلة تنازلية من الميثانول في عكس ما ثبت للتو، وغسل العينات مرة واحدة لمدة ساعة واحدة في أربعة ملليلتر من برنامج تلفزيوني بعد غمر الميثانول 20٪. للمناعة من أقسام أنسجة المخ غسل العينات مرتين لمدة ساعة واحدة في أربع ملليلتر من 0.2٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني، تليها permeabilization لمدة يومين في 37 درجة مئوية في أربع ملليلتر من 0.2٪ تريتون X-100، 20٪ ثنائي الفينيل سولفوكسيد، و 0.3 المولار الجليسين في PBS.
كتلة أي ربط غير محدد مع أربعة ملليلتر من 0.2٪ تريتون X-100، 10٪ ثنائي الفينيل السلف، و 6٪ مصل طبيعي في برنامج تلفزيوني لمدة يومين في 37 درجة مئوية. في نهاية التسمية حجب الحضانة العينات مع مليلترين من محلول الأجسام المضادة الأولية لمدة خمسة أيام في 37 درجة مئوية، منعش حل الأجسام المضادة بعد يومين و 1/2. بعد ذلك، قم بغسل العينات ليوم واحد في أربعة ملليلترات من 0.2٪ توين 20 و10 ميكروغرام لكل ملليلتر الهيبارين في PBS تبادل عازلة غسل ما لا يقل عن أربع إلى خمس مرات خلال اليوم وترك الغسيل النهائي في ليلة وضحاها.
في اليوم التالي، احتضان العينات في مليلترين من محلول الأجسام المضادة الثانوية لمدة خمسة أيام في 37 درجة مئوية. ثم غسل العينات في أربعة ملليلتر من 0.2٪ Tween الطازجة 20 و 10 ميكروغرام لكل ملليلتر الهيبارين في برنامج تلفزيوني كما هو موضح. لتلطيخ نوويّة من العينات ينقب العينات في أربعة ملليلتر من الحمّل نوويّة وصمة عار TO-PRO-3 لخمسة ساعات حميت من ضوء.
في نهاية الحضانة غسل العينات في 0.2٪ توين 20 و 10 ميكروغرام لكل ملليلتر الهيبارين في برنامج تلفزيوني كما هو موضح، تليها الجفاف في سلسلة الصعود من البيروتانول العليا لمدة ساعتين لكل غمر. بعد 90٪ نقل الغمر العينات إلى 96٪ حل ثلثي بوتانول بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي، يجفف العينات في 100٪ من البوتانول لمدة ساعتين قبل إزالة أقسام الأنسجة في BABB-D15 المعدة حديثًا لمدة ساعتين إلى ست ساعات حتى تكون شفافة بصريًا.
ويمكن بعد ذلك تخزين العينات في BABB-D15 محمية من الضوء حتى تركيبها والتصوير. بالنسبة للعينة التركيبة استخدم طابعة ثلاثية الأبعاد لطباعة حجرة وغطاء تصوير. جبل 30 ملليمتر قطرها أغطية على غرفة التصوير مع درجة حرارة غرفة مكون واحد vulcanizing مطاط السيليكون.
وبالمثل، جبل 22 ملليمتر يغطي على الغطاء. استخدام مسحة القطن الماء اتم لإزالة المطاط السيليكون الزائد على كلا الحلقتين قبل السماح للمطاط لعلاج بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، ضع عينة في غرفة التصوير وأضف حجمًا صغيرًا من BABB-D15 إلى الغرفة قبل إدخال الغطاء.
باستخدام إبرة تحت الجلد ملء الغرفة مع BABB-D15 من خلال مدخل وتوصيل مدخل قبل ختم غرفة التصوير مع المطاط السيليكون. لإعداد الحصول على الصورة حدد خطوط الليزر المناسبة للفلوروفوريس المستخدمة، وضبط نطاقات الكشف عن كل كاشف لمنع تداخل الإشارة بين القنوات. ثم قم بتعيين معلمات الاكتساب للعثور على الحد العلوي والسفلى من المكدس Z والحصول على رصة الصورة.
لإنشاء إسقاطات 3D من كومة الصور فتح ملفات الصور في فيجي وحدد صورة لون قنوات أداة المزيد وقنوات الانقسام لتقسيم الصور المدمجة في قنوات فردية. لتصحيح التبييض للصور، حدد لكل قناة تصحيح ضبط التبييض للصور وحدد نسبة بسيطة. استخدم أشرطة التمرير لضبط السطوع والتباين لكل قناة، وحدد ألوان الصور وقنوات الدمج.
حدد الخيار إنشاء مركب. قم بتحويل الصورة إلى تنسيق RGB وحدد مكدسات الصور ومشروع ثلاثي الأبعاد لإنشاء عرض ثلاثي الأبعاد. حدد ألمع نقطة كأسلوب الإسقاط وقم بتعيين تباعد الشرائح ليتناسب مع حجم الخطوة Z من مكدس الصور المكتسبة.
للحصول على أقصى جودة تعيين زيادة زاوية دوران إلى واحد وتمكين الاستيفاء. تعديل إجمالي استدارة وعتبات الشفافية والعتامة حسب الحاجة. ثم احفظ العرض ثلاثي الأبعاد بتنسيقي ملفات tiff و AVI.
يمكن تصور استخدام المناعة من فيروس داء الكلب الفوسفوبروتين طبقات معقدة من الخلايا العصبية المصابة في أجزاء سميكة من عينات أنسجة الدماغ الماوس. في وقت لاحق، يمكن إعادة بناء الإسقاطات ثلاثية الأبعاد السلسة لمكدسات الصور المكتسبة. وبسبب الدقة العالية التي يتم بها الحصول على أكوام الصور، يمكن تقييم العدوى حتى مستوى خلية واحدة، مما يسمح بتأكيدات حول، على سبيل المثال، وفرة وتوزيع المستضد داخل خلية ذات فائدة.
بالإضافة إلى أنسجة الدماغ الماوس، يمكن تطبيق البروتوكول على عينات أنسجة الدماغ من الأنواع الحيوانية الأخرى. على سبيل المثال، تكشف الأقسام التي تم الحصول عليها من أجزاء مختلفة من الدماغ النمسي المصاب عن درجة متفاوتة من عدوى فيروس داء الكلب. يمكن تمييز الخلايا الفلكية عن طريق التعبير عن بروتين حمض الهرفان الدبقية في حين يمكن أن تكون ملطخة على وجه التحديد للنيوريات البروتين المرتبطة ميكروتيبول II.Simultaneous، يمكن أن تكون البروتينات الفيروسية الملطخة لتقييم العلاقة بين الخلايا المصابة وتسليط الضوء على السكان الفرعية الخلوية.
للمناعة اختيار الأجسام المضادة للكشف عن البروتينات من الفائدة أمر بالغ الأهمية. في حين أن تركيزات المناعة المعيارية القياسية غالبًا ما تكون نقطة انطلاق جيدة ، فقد تحتاج بعض الأجسام المضادة إلى تعديل إضافي. العديد من المواد الكيميائية المستخدمة في هذا البروتوكول لها خصائص ضارة.
إجراء التجربة ذات الصلة في غطاء الدخان ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة بما في ذلك معطف المختبر والقفازات.
