يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على العديد من الأسئلة الرئيسية التي ينطوي عليها إنتاج حليب الأم oligosaccharides. أولاً، كم من المنتج لدي؟ وثانياً، ما هو الرابط المحدد للكربوهيدرات؟
والهدف هنا هو تبسيط وتسريع عملية تحديد خصائص وسم هذه الدهون في الحليب البشري. هذه الطريقة لها ميزتان على الحالة الحالية للفن. أولاً، إنه قابل للفحص عالي الإنتاجية.
لذلك، يمكنك أن تتخيل اختبار الآلاف من الظروف المختلفة أو ربما حتى مكتبة من الانزيمات التوليف في يوم واحد باستخدام هذه التقنية. أيضا، فإنه يستخدم خصوصية الركيزة الفريدة التي تطورت الطبيعة في الانزيمات لتعطينا معلومات حول ربط الكربوهيدرات تلك oligosaccharides. ونحن نعتقد أن هذه الطريقة يمكن أن تحسن إنتاج حليب الأم oligosaccharides، والتي بدورها يمكن أن تؤدي إلى حليب الرضع نوعية أفضل أن يحاكي عن كثب حليب الثدي البشري وتساعد على سد الفجوة بين الأطفال الرضاعة الطبيعية والرضاعة الطبيعية.
ويوصى المستخدم السلطة التقديرية عند اتخاذ قرار ما طريقة لاستخدام لإزالة اللاكتوز على أساس التكلفة والإنتاجية وتوافر المعدات. وينبغي توخي الحذر لضمان إزالة اللاكتوز الأمثل. في اليوم السابق للتجربة، بذور 5 ملليلتر من LB المتوسطة تكملها مع الكناميسين والكاربينسيلين من مستعمرة بكتيرية جديدة باستخدام تقنيات معقمة.
احتضان جميع الثقافات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع الهياج. في اليوم التالي، نقل 50 ميكرولترات من ثقافة بين عشية وضحاها إلى خمسة ملليلتر من وسائل الإعلام LB M9 الطازجة مع الكناميسين والكاربينيسيلين. احتضان في 37 درجة مئوية مع اهتزاز مستمر حتى الثقافة قد وصلت إلى OD600 بين نقطة الصفر 5 و صفر نقطة سبعة.
أولاً، نقل الثقافات بين عشية وضحاها إلى نقطة واحدة خمسة أنابيب ملليلتر وطاردة مركزية في 12،500 مرة ز لمدة دقيقة واحدة. تجاهل عظمى وإعادة تعليق بيليه في 500 ميكرولترات من 1X برنامج تلفزيوني لإعداد تعليق خلية واحدة. نقل تعليق الخلية الواحدة إلى أنابيب الفاكس.
استخدم مقياس تدفق للتدفق لإثارة GFP وجمع مستويات الفلورس في فيتC كما هو موضح في بروتوكول النص. لجعل منحنى المعايرة، وجعل ثمانية إلى 10 التخفيفات من 2'FL القياسية في نطاق بين صفر و 2500 ملليغرام للتر الواحد. ثقافة خلايا الاستشعار الحيوي 2'FL والحث عليها مع التخفيفات القياسية على النحو المبين في بروتوكول النص.
بدء ثقافة من سلالة إنتاج 2'FL في خمسة ملليلتر من وسائل الإعلام LB وتنمو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. في اليوم التالي, ثقافة فرعية في 1٪ في 250 ملليلتر من وسائل الإعلام أعدت الحد الأدنى وإضافة الجلسرين إلى تركيز النهائي من 10 غراما للتر الواحد. احتضان في 37 درجة مئوية حتى تصل الثقافة وOD600 بين نقطة الصفر خمسة وصفر نقطة سبعة.
ثم يضاف IPTG إلى تركيز نهائي من نقطة الصفر خمسة ملليمترات و اللاكتوز إلى تركيز نهائي من غرامين لكل لتر. احتضان في 37 درجة مئوية مع اهتزاز مستمر لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي، نقل ثقافة بين عشية وضحاها إلى أنابيب 50 ملليلتر العقيمة والطرد المركزي في 900 مرة ز لمدة 15 دقيقة.
تجاهل المابير وإعادة تعليق بيليه في المياه ديون. كرر هذا الغسيل ثلاث مرات لإزالة أي اللاكتوز المتبقية. بعد هذا، إعادة تعليق بيليه في خمسة ملليلتر من المياه الأيونية.
وضع الخلايا على الجليد واستخدام سونيكاتور في 30٪ السلطة في 30 ثانية نبضات لlyse تعليق الخلية. الطرد المركزي الخلايا lysed في 2، 000 مرة ز لمدة 25 دقيقة. إزالة ناظر وتمريره من خلال مرشح عقيم.
تخزين مصفى مصفى في أربع درجات مئوية حتى جاهزة للتحليل. المقبل، تلقيح ثقافة من 2'FL خلايا الاستشعار البيولوجي. في منتصف مرحلة السجل، والحث الخلايا مع الخلية lysate في تركيزات تعادل تلك التي 2'FL المستخدمة لجعل منحنى المعايرة.
تنفيذ المعايرة كما هو موضح في بروتوكول النص. بعد ذلك، قم بتشغيل العينات على مقياس تدفق. توليد منحنى استجابة جرعة عن طريق رسم الانتاج fluorescence ضد تركيز oligosaccharide ومقارنة استجابة المعايير لlysate الخلية.
أولاً، حل FL alphalyzed بيتا galactosidase إلى 1،000 وحدة لكل ملليلتر في كلوريد المغنيسيوم ملليمولار واحد. لتحديد التركيز الأمثل للإنزيمات اللازمة، تنمو inoculum من 2'FL خلايا الاستشعار البيولوجي وفي مرحلة منتصف سجل، والحث مع اللاكتوز و2'FL. إلى 100 الثقافات microliter، إضافة كميات متغيرة من بيتا galactosidase تصل إلى 12 وحدة.
دع الثقافات تنمو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع اهتزاز مستمر. قياس الفلوريس كما هو موضح في بروتوكول النص وحساب الوحدات المثلى من الانزيم اللازمة عن طريق تحديد الحد الأدنى من تركيز الانزيم لتحقيق التوهين المطلوب من إشارة. إلى 2'FL إنتاج الخلايا التي نمت لمدة 24 ساعة إضافة وحدات الأمثل من بيتا galactosidase واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، وتحديد 2'FL titre كما هو موضح سابقا.
أولاً، ابدأ ثقافة 25 ملليلتر من سلالة إنتاج 2'FL. وبمجرد أن يتم تحفيز السلالة في مرحلة منتصف السجل، قم باحتضان الثقافة عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. بعد ذلك ، تلقيح ثقافة E.coli BL21 في وسائط LB.
تنمو إلى منتصف مرحلة السجل في 37 درجة مئوية ثم إضافة 15 ملليلتر من هذه الثقافة إلى ثقافة 2'FL 24 ساعة. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات. ثم، تحديد 2'FL titre كما هو موضح سابقا.
للبدء، بدء ثقافة 25 ملليلتر من سلالة إنتاج 2'FL. وبمجرد أن يتم تحفيز السلالة في مرحلة منتصف السجل، قم باحتضان الثقافة عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. إضافة مجلدين من الإيثانول 100٪ إلى الثقافة وتهز جيدا.
احتضان في 37 درجة مئوية لمدة أربع ساعات. ثم، الطرد المركزي تعليق في 900 مرة ز لمدة 15 دقيقة. جمع فائقة واحتضان بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية لتسريع اللاكتوز.
تمرير الحل من خلال ورقة مرشح لإزالة اللاكتوز المترسب. جمع الترشيح الذي يحتوي على lysate الخلية وتحديد 2'FL titre كما هو موضح سابقا. في هذه الدراسة، يتم استخدام استراتيجية عالية الإنتاجية للكشف عن الربط المحدد من oligosaccharides الحليب البشري fucosylated.
ويتم ذلك عن طريق بناء كامل الخلية البيولوجية أجهزة الاستشعار عن طريق الهندسة الوراثية E.Coli التي، عند الاستقراء مع الجليكان محددة، والاستجابة مع إشارة الفلورسنت. إشارة الفلورسنت في ظل ظروف مختلفة من الحث كما تم تحليلها على تدفق مقياس التحلل، ويظهر أكثر من 100 ضعف زيادة في الفلورسيه مع 2'FL الاستشعار الحيوي مقارنة مع ناقلات فقط التحكم أو الاستشعار الحيوي ل3'FL. وهذا يدل على خصوصية الربط العالية للمستشعر الحيوي.
يمكن تحديد حساسية المقايسة عن طريق توليد منحنى استجابة الجرعة مع مستويات الكربوهيدرات متفاوتة. ويعتبر النطاق الخطي الديناميكي للكشف 2'FL، ليكون بين 40 و 400 ملليغرام للتر الواحد والحد من الكشف هو أربعة ملليغرام للتر الواحد. يمكن إجراء هذا الفحص على مدار يوم عمل كما يتضح في قياسات اللقطة المفاجئة لديناميات تعبير المراسل.
يمكن استخدام خلايا الاستشعار الحيوي للكشف عن وقياس 2'FL من سلالة منتج 2'FL المهندسة باستخدام عدد من الاستراتيجيات للحد من الإشارة من اللاكتوز الخارجية بحيث تكون الإشارة التي تم قراءتها تتوافق مباشرة مع تركيز 2'FL. استراتيجية واحدة هي أن تتحلل الأنزيمية اللاكتوز باستخدام جلاككتوزيدز بيتا التي لا تعمل على اللاكتوز المعدلة. استراتيجية أخرى تستخدم الإيثانول الذي ليس فقط بشكل انتقائي يعجل اللاكتوز ولكن أيضا lyses الخلايا المنتجة منذ الخلايا تحلل هو خطوة ضرورية إلى أسفل تيار.
وأخيرا، فإن الأسلوب الأكثر فعالية ولكن مضيعة للوقت هو بيليه وغسل الخلايا قبل تحلل الخلايا للافراج عن 2'FL داخل الخلايا. وبمجرد أن نؤسس هذه الطريقة، تمكنا من توسيع نطاق ذخيرة الأهداف oligosaccharide باستخدام إنزيمات مختلفة. حاليا، يمكننا الكشف عن تسعة oligosaccharides مختلفة ونحن نعمل على أكثر من ذلك.
في حين أن الأمثل هذا الفحص، لاحظنا متانة الإنزيمات لدينا سمح لنا بالخروج مع تقنية تعطي ربط محدد قراءة في حوالي خمس دقائق. وعلى الرغم من أن أياً من الكواشف المستخدمة هنا لا يتسم بالخطورة على وجه الخصوص، فإن أولئك الذين يستخدمون هذه الطريقة ينبغي أن يتبعوا إجراءات المخاطر البيولوجية والاحتواء البيولوجي القياسية بما في ذلك ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة.
