إعداد حبيبات غوشوكانغ (GSK) للتجارب في الجسم الحي وفي المختبر

هذا البروتوكول مرافق إعداد حل عمل من حبيبات لفي دراسات الجسم الحي، فضلا عن إعداد مصل تحتوي على حبيبات للتجارب في المختبر. إحدى مزايا هذه التقنية هي أن الطريقة يمكن تكرارها بسهولة بسبب انخفاض تكلفة المواد والحيوانات التي تنشئها للتجارب. تبدأ بإضافة ثمانية، 16، و 24 غراما من غوشوكانغ، أو GSK، حبيبات إلى أنابيب فردية 50 ملليلتر.

إضافة 48 ملليلتر من الماء إلى كل أنبوب، وتهز الأنابيب إلى حل الحبيبات تماما. ثم، ضع 1.6 حبة من كربونات الكالسيوم المكملة بفيتامين D3 في أنبوب آخر 50 ملليلتر، وقم بحل الأقراص في 48 ملليلتر من المالحة مع اهتزاز. لإدارة داخل المعدة من الحلول، أولا بلطف ولكن بحزم يدويا كبح جماح شهر واحد من العمر، أنثى، C57 الأسود 6 الماوس لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق.

عندما هدأ الماوس، تحميل 40 ملليمتر، وعدد 12 إبرة gavage مع 0.24 ملليلتر من حل واحد يعمل من حبيبات GSK، ووضع إبرة gavage في الماوس من خلال جانب واحد من فمه حتى يتم الشعور المقاومة إبرة، مما يدل على أن الإبرة قد وصلت إلى المعدة. حقن كامل حجم حل العمل في الحيوان. ثم، تراجع إبرة gavage، والعودة الماوس إلى قفصه بينما يتم إعطاء الفئران الأخرى GSK قبل حقن 0.24 ملليلتر من كربونات الكالسيوم وفيتامين D3 حل في كل فأرة بنفس الطريقة.

لجمع الدم المحتوي على GSK ، بعد تسليم التركيزات المناسبة من GSK إلى جرذ من قبل gavage كما هو موضح للتو ، تؤكد عدم الاستجابة لقرصة إصبع قدمه بعد ساعة واحدة من إدارة حبيبات GSK الأخيرة. جعل الجلد البطني وشق البريتوني، وفضح البطن إلى الجزء السفلي من الصدر. استخدم ورق الأنسجة لإزالة النسيج الضام من الشريان الأورطي البطني لفضح الوعاء بشكل واضح، واستخدم حقنة 10 ملليلتر مجهزة بإبرة من عيار 22 لسحب الدم من الشريان الأورطي.

نقل الدم إلى أنبوب 15 ملليلتر معقمة، ووضع أنبوب تستقيم في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 إلى 60 دقيقة. عندما تتخثر الدم، الطرد المركزي أنبوب لفصل المصل، ونقل كل من المصل لمدة تصل إلى ستة فئران في أنبوب جديد 50 ملليلتر. هز الأنبوب لخلط سيرا قبل تعطيل مكونات المصل في حمام مائي 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

ثم، تصفية المصل من خلال 0.22 ميكرومتر المسامية البولي ثيرسولفون مرشح حقنة لتخزين في ناقص 80 درجة مئوية لمدة تصل إلى عام. لـ في المختبر العظمي، تمييع الجرعات الثلاث من مصل يحتوي على GSK بنسبة واحد إلى أربعة مع الحد الأدنى المتوسط النسر تستكمل مع L-الجلوتامين، ريبونوكليوسيدات، وديوكسيريبونوكليوسيد. أضف 200 ميكرولترات من كل تخفيف إلى كل بئر من ثقافة الضامة نخاع العظم في لوحة 96 جيدا.

ثم, بدء توليد أوستيوكلات من خلال تحفيز كل بئر مع عامل الضامة المحفزة مستعمرة والمستقبِل للمُستقبِل للعامل النووي-كابا B ligand. لـ في المختبرات العظمية، أضف ملليلترين من المصل المخفف المحتوي على GSK إلى كل بئر من 24 بئرًا لثقافة الخلايا الجذعية النخاعية للعظم 24 بئرًا. تشير نتائج المسح المقطعي المحوسبة الدقيقة إلى أن الفئران ذات المتغيرات المُجَزَعَة تُظهر فقدانًا كبيرًا للعظام مقارنة بفئران التحكم بالملوحة المالحة.

التدخل مع 90 يوما من العلاج الحبيبية GSK يزيد كثيرا من كثافة نخاع العظام، وخاصة في جرعة متوسطة GSK الحيوانات المعالجة. كما يؤدي علاج حبيبات GSK إلى زيادة عدد العظام البرمية ، وحجم العظام على الحجم الإجمالي ، وسمك العظام الترابلية ، ولكن انخفاض فصل العظام الترابلية للعظام. phosphatase حمض طرطرات المقاومة، أو TRAP، تلطيخ يكشف عن زيادة في عدد العظام في الفئران ovariectomized بالمقارنة مع الحيوانات التحكم، في حين أن العلاجات حبيبات GSK تقليل تمايز OSTeoclast TRAP إيجابية بالمقارنة مع الحيوانات ovariectomized.

كما يقلل المصل المحتوي على حبيبات GSK من عدد العظام الإيجابية TRAP مقارنة بالمصل الذي تم جمعه من الحيوانات الخاضعة للتحكم. إن الاختراق الناجح للإبرة في الشريان الأورطي البطني أمر بالغ الأهمية لضمان حصاد كمية كبيرة بما يكفي من الدم من كل فأر. وينبغي أن يؤدي التنفيذ الناجح لهذه الطريقة إلى تخصيص تراكم 15 إلى 20 ملليمترا من الدم، وهو ما يكفي من المواد لاستخدامها في التجارب المختبرية.