يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول تطوير الأفلام الحيوية، مثل كيفية تحديد الظروف البيئية الرئيسية، التي تؤثر على نمو الأفلام الحيوية والخصائص السلوكية أثناء التطوير. والميزة الرئيسية لهذه التقنية، هي أن لوحات متعددة القنوات، ومائعة الصغر، تسمح للحصول السريع على نتائج ذات دلالة إحصائية. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة في بنية بيو فيلم، فإنه يمكن أيضا أن تطبق على دراسة العلاجات بالمضادات الحيوية، والعلاج الحيوي.
عموما، سوف الأفراد جديدة لهذا الأسلوب النضال، لأن الاهتمام الدقيق لتفاصيل البروتوكول والمهارات الدقيقة، وهناك حاجة. لتجنب خطأ في اتصال الجهاز إلى البرنامج، قم بتشغيل محطة عمل الكمبيوتر أولاً، متبوعة بوحدة الفلوريسانس. تأكد من تشغيل مصراع الفلوريسنس، ثم قم بتشغيل وحدات تحكم الأجهزة.
بعد ذلك، قم بتشغيل وحدة تحكم نظام التصوير وكاميرا CCD. ثم قم بتشغيل محطة التصوير. عندما تكون جميع المعدات جاهزة، ابدأ تطبيق التحكم، وأدخل رقم اللوحة، الموجود على الملصق على جانب اللوحة.
لالفْرَة، أولاً قم بإزالة 48 لوحة مُمَولة صغيرة من العبوة، دون لمس سطح الزجاج في الجزء السفلي من اللوحة، ونظف الشريحة الزجاجية في قاع اللوحة، مع نسيج العدسة. لر رئيسية القنوات الصغيرة fluidic، ماص 200 ميكرولترات من 37 درجة مئوية الحد الأدنى المتوسطة في الإنتاج جيدا، مع الحرص على تجنب فقاعات. ثم ضع لوحة على خشبة المسرح لوحة.
امسح الواجهة بالإيثانول، وختمه على خشبة المسرح بمجرد أن يجف الإيثانول. في الوضع اليدوي على وحدة التحكم، تعيين السائل كما مرق لوريا-بيرتاني في 37 درجة مئوية، والحد الأقصى للدرجة خمسة dym لكل سنتيمتر مربع. انقر فوق آبار الإخراج لتنشيط التدفق من الناتج إلى الإدخال بشكل جيد ، إلى رئيس الوزراء القنوات.
بعد خمس دقائق، وقف تدفق للتحضير للبذاءة، وإزالة بعناية لوحة من المرحلة. ثم، التعرق أي وسيط المتبقية من الانتاج جيدا دون إزالة أي وسيلة من الدائرة الداخلية التي تؤدي إلى القنوات مائع الصغرى. لزرع القنوات التجريبية، إضافة 300 ميكرولترات من الحد الأدنى من المتوسطة في جيدا المدخلات، تليها إضافة 300 ميكرولترات من الثقافة البكتيرية، في الإنتاج جيدا.
أعيدي اللوحة إلى مرحلة التصوير مع التأكد من مسح الواجهة بالإيثانول قبل وضعها على اللوحة، واستخدام تغذية الكاميرا المباشرة للتركيز على قناة واحدة. أثناء مراقبة البث المباشر بصريًا ، استئناف التدفق من 1 إلى 2 dym لكل سنتيمتر مربع لمدة 2 إلى 4 ثوان تقريبًا ، للسماح للخلايا بدخول القناة التجريبية ولكن ليس القنوات الثعبانية ، وترك اللوحة على درجة الحرارة التي تسيطر عليها لمدة ساعة واحدة ، للسماح للخلايا بالتصاق. في نهاية فترة المرفق، وإزالة لوحة بعناية من المرحلة وpirate البكتيريا من الإخراج بشكل جيد دون إزعاج القناة.
ثم استخدم طرف ماص جديد لإزالة الوسيطة من الآبار المدخلة. في البرنامج ، وفتح متعددة الأبعاد اقتناء للسيطرة على الحصول على صورة المجهر ، وتحديد الفاصل الزمني ، وظائف مرحلة متعددة ، وأطوال موجية متعددة. في علامة التبويب الحفظ، قم بإنشاء اسم أساسي بسيط، مع التأكد من أن incroments الاسم الأساسي في حالة وجود ملف، يتم التحقق منه.
تضمين أي تفاصيل أساسية عن التجربة في الوصف. انقر فوق تحديد الدليل، لتحديد المجلد الذي سيتم حفظ كافة الملفات فيه تحت علامة التبويب الفاصل الزمني، وضبط مدة الوقت التجريبي، إلى 24 ساعة، وتعيين الفاصل الزمني للحصول على الصور كل خمس دقائق خلال التجربة. استخدم تغذية الكاميرا المباشرة والهدف 10x لتعيين مواضع المرحلة ، مع التركيز على مركز القناة ، الموجود فوق أو أسفل أرقام القناة المحفورة على اللوحة.
قم بالتبديل إلى الهدف 20x، وحدد موقع منطقة العرض المثالية والطائرة البؤرية داخل القناة. ثم قم بإضافة موضع المرحلة إلى القائمة مع الإعدادات الجديدة. تحت قائمة الأطوال الموجية، تعيين عدد الأطوال الموجية إلى 3، وتعيين الطول الموجي الأول إلى الكاميرا 100٪ فيتك، مع عشر مللي ثانية وقت التعرض، الطول الموجي الثاني إلى كاميرا brightfield 50٪ مرئية 50٪، مع الحد الأدنى من وقت التعرض من 3 مللي ثانية وطول الموجة الثالث إلى جميع مغلقة، لذلك لا يبقى أي ضوء على القناة الأخيرة بين أوقات الاستحواذ.
في القائمة تحرير التشغيل التلقائي، افتح علامة تبويب إعداد البروتوكول، ثم قم بتعيين بروتوكول جديد لمدة 24 ساعة مع ضبط التدفق في الاتجاه الأمامي بمعدل القص التجريبي المناسب. انقر فوق إضافة وحفظ كما لحفظ البروتوكول وفتح علامة التبويب إعداد التسلسل. لإعداد تسلسل جديد، حدد مرق Luria-Bertani عند 37 درجة، كسائل افتراضي لجميع القنوات.
ضمن الخطوة التكرار 1 للقنوات من 1 إلى 12، حدد البروتوكول مع معدل القص التجريبي الأول وتمكين كافة القنوات. بالنسبة للقنوات من 13 إلى 24، حدد البروتوكول مع معدل القص التجريبي الثاني وتمكين جميع القنوات. ثم حدد تطبيق وحفظ باسم، لحفظ التسلسل وفتح القائمة التشغيل التلقائي لتحديد التسلسل المحفوظ لاستخدامه في التشغيل التلقائي.
لإعداد تجربة بيو فيلم النمو في الوقت المناسب، إضافة ما يصل إلى 1300 ميكرولترات من المتوسط العقيم الحد الأدنى في بئر المدخلات من لوحة صغيرة fluidic، والعودة لوحة إلى مرحلة التصوير. ثم، مسح واجهة مع الإيثانول، وختم لوحة. تأكد من إعداد البروتوكولات والتسلسلات بشكل صحيح.
حدد بدء تشغيل التشغيل التلقائي، وانقر فوق الحصول على الفور لبدء مجموعة الصور المجهر. في نهاية الحصول على الصورة الأولى، انقر على إيقاف مؤقت وحدد وضع الصورة المباشرة في الطول الموجيfieldfield. حدد الانتقال إلى لعرض كل موضع مرحلة، وحدد مجموعة إلى الحالي، لتعيين الإعدادات الجديدة.
ثم انقر فوق استئناف، قبل البدء في عملية الاستحواذ المجدولة التالية. في هذه التجربة التمثيلية لنمو الأغشية الحيوية، كانت تغطية البيوفيلم، أو مساحة السطح في المائة، مختلفة بالنسبة لجميع إعدادات القص الثلاثة، مما يشير إلى أن القص كان له تأثير مباشر على تغطية سطح البيوفيلم. وقد زاد مجموع القياس النسبي لتراكم الغشاء الحيوي، كدالة للوقت، مع انخفاض معدل النمو من أعلى إجهاد القص إلى أدنى إجهاد القص.
وفي ظل كل حالة، كانت هناك أيضا فترة واضحة من النمو الأسي يمكن أن تحسب منها معدلات النمو الكمي. وبشكل عام، انخفض معامل الخشونة بمرور الوقت في ظل جميع ظروف القص، مما يشير إلى أن جميع أسطح البيوفيلم أصبحت أكثر سلاسة. ومع ذلك، مقارنة بأقل القص، أدت إعدادات القص الأعلى إلى سطح أكثر سلاسة بمرور الوقت، مما يشير إلى أن تدفق القص الأسرع يساهم في سطح أكثر سلاسة وأكثر سلاسة.
علاوة على ذلك ، زادت الكونتروبيا التركيبية ، أو العشوائية في المورفولوجيا ، بمرور الوقت لجميع ظروف القص. أثناء تنفيذ هذا الإجراء من المهم أن نتذكر أن تتبع التسلسل المحدد وأن تأخذ من الوقت لتنفيذ كل خطوة بدقة. المهارات اللازمة يمكن أن يستغرق بضعة أشواط لإتقان.
بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل HBLC أو GCMS للإجابة على أسئلة إضافية حول تركيزات الركائز، مثل الجلوكوز، التي يتم استهلاكها. بعد تطورها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الأفلام الحيوية لاستكشاف بيئات التدفق العام في الوقت الحقيقي مع الظروف التجريبية الخاضعة للرقابة وأخذ عينات من العلاج المائي. لا تنس أن العمل مع سلالات BSL2 البكتيرية يمكن أن تكون خطرة للغاية، وأن الاحتياطات مثل ارتداء معدات الحماية المناسبة واستخدام بروتوكولات النفايات المناسبة ينبغي اتخاذها دائما أثناء تنفيذ هذا الإجراء.
