هذه الطريقة يمكن الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول NK مستقبلات الخلايا الجينية مثل تنوع haplotype وكيف يرتبط هذا المرض. سوف العرض التوضيحي البصري لهذه الطريقة يساعد على تعيين البروتوكول في المختبر الخاص بك، بما في ذلك عملية الأتمتة وتحليل البيانات. المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي أنه ، على عكس الطرق التقليدية ، qKAT ، التي ترمز إلى الكتابة الآلية الكمية KIR ، عالية الإنتاجية وتوفر رقم نسخة الجينات.
qKAT يمكن أن توفر نظرة ثاقبة جمعية المرض. يمكن أن تكون الآثار المترتبة على هذه التقنية مفيدة لعلاج العدوى الفيروسية مثل فيروس نقص المناعة البشرية والتهاب الكبد C ، في السرطان ، في زرع الخلايا الجذعية ، واضطرابات الحمل. qKAT يمكن أيضا أن تطبق في دراسة علم الوراثة السكانية وكذلك استكشاف التعبير والتفاعلات الوظيفية بين KIR و HLA جزيئات.
qKAT يتكون من 10 ردود الفعل المتعددة التي تستهدف على وجه التحديد exons من جينات KIR اثنين وجين مرجع واحد. في هذا البروتوكول، تم تصميم التمهيديات محددة للكشف عن أليل الجين معين ونتائج PCR في amplicons قصيرة. بعد ذلك، يتم استخدام مسابير التحلل المائية المحددة ذات التسمية المزدوجة لمراقبة تضخيم PCR في الوقت الحقيقي.
يستخدم تحليل رقم النسخ القياس الكمي النسبي لجينات KIR المستهدفة إلى جين مرجعي. تم تصميم qKAT وإعدادها لتكون تقنية عالية الإنتاجية. وبالتالي، يمكن تنفيذ كل رد فعل على عينات أقل من 1000.
الخطوات التالية تظهر الخطوات التي ينطوي عليها إعداد والطلاء من كل 96 جيدا الحمض النووي لوحة. للبدء ، بعد تحديد الحمض النووي ، وتمييع الحمض النووي في لوحة 96 جيدا عميق جيدا. تضمين نموذج تحكم واحد على الأقل مع رقم نسخة معروف و عنصر تحكم واحد غير قالب.
جهاز طرد مركزي في لوحة 450 gs لمدة دقيقتين. ثم، الاستغناء عن كل عينة في quadruplicate في 384 جيدا qPCR لوحات. بعد ذلك، يجفف الهواء الحمض النووي في منطقة نظيفة في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة.
لإعداد رد فعل qKAT واحد للوحات 384 10 بئر ، أولا ، إزالة الجليد في المخزن المؤقت qPCR ، التمهيدي ، ومسبار aliquots في أربع درجات مئوية. إعداد مزيج الرئيسي على الجليد وفقا لبروتوكول النص. ثم، استخدام ماصة متعددة القنوات لتوزيع مزيج الرئيسي بالتساوي عبر لوحة 96 جيدا عميق جيدا.
الاستغناء 9.5 ميكرولترات من مزيج الرئيسي في كل بئر من لوحة مع عينات gDNA المجففة. بعد ذلك، ختم لوحة مع احباط وتخزينها على الفور في أربع درجات مئوية. تذكر أن تقوم بغسل ماء قصير لتنظيف الإبر من نظام المناولة السائلة إذا كان الاستغناء عن مزيج رئيسي على أكثر من واحد 384-جيداً لوحة الحمض النووي.
الطرد المركزي لوحة مع عينات gDNA في 450 gs لمدة ثلاث دقائق. ثم، احتضان لوحة في 4 درجات مئوية لإعادة تعليق الحمض النووي وتبديد أي فقاعات الهواء. بعد احتضان لوحة بين عشية وضحاها، كرر الطرد المركزي لتبديد أي فقاعات الهواء.
ثم ضع اللوحة في حوض التخزين المبرد. قم بتوصيل جهاز qPCR بمعالج microplate. ثم قم ببرمجة معالج microplate وفقاً لبروتوكول النص.
بمجرد اكتمال الركض ، يكون الروبوت جمع لوحة من آلة qPCR ووضعها في قفص الاتهام المهملة. بعد الانتهاء من التضخيم، افتح برنامج qPCR. ضمن علامة التبويب Navigator ، افتح ملف تجربة التفاعل المحفوظة لطبقة.
بعد ذلك، افتح إطار إنشاء تحليل جديد وحدد الإعدادات المناسبة لأسلوب الحد الأقصى المشتقة 2. ثم حدد تصفية مشط وتأكد من تحديد البيانات التي تم جمعها لـ STAT6. حدد تعويض اللون المناسب.
انقر فوق حساب، ثم انقر فوق حفظ الملف. لتحليل البيانات باستخدام الأسلوب "نقاط ملائمة" ، افتح إطار إنشاء تحليل جديد وحدد الإعدادات المناسبة لـ Fit Points method . ثم حدد عوامل التصفية الصحيحة وتعويضات الألوان لـ STAT6.
تعيين شريط الضوضاء لاستبعاد الضوضاء الخلفية. بعد ذلك، افتح علامة التبويب تحليل وتعيين نقاط ملائمة إلى ثلاثة، وحدد إظهار نقاط ملائمة. احفظ التغييرات وكرر الخطوات مع الإعدادات المناسبة لتحليل نقطة الملاءمة و 2nd Derivative لمورثات KIR.
افتح علامة التبويب Navigator في برنامج qPCR وحدد نتائج دفعة التصدير. ثم افتح المجلد الذي يحتوي على ملفات التجربة ثم نقلها إلى الجانب الأيمن من الإطار. انقر فوق التالي، وحدد اسم ملف التصدير وموقعه.
بعد ذلك، حدد نوع التحليل من الفائدة وانقر فوق التالي. تأكد من صحة اسم الملف ومجلد التصدير ونوع التحليل قبل النقر فوق التالي لبدء عملية التصدير. عندما تتغير حالة التصدير إلى موافق، ستنتقل الشاشة تلقائيًا إلى الخطوة التالية.
تأكد من أن كافة الملفات المحددة قد تم تصديرها بنجاح وانقر فوق تم. ثم استخدام البرامج النصية في بروتوكول النص لتقسيم لوحات تصديرها إلى ردود فعل فردية وتحويل الملفات إلى برنامج مقروءة من قبل برنامج تحليل رقم نسخة. بعد ذلك، افتح برنامج تحليل رقم النسخة وحدد استيراد ملف نتائج PCR في الوقت الحقيقي لتحميل الملفات النصية التي تم إنشاؤها بواسطة البرامج النصية.
وأخيراً، حدد تحليل، وقم بإجراء التحليل عن طريق تحديد معظم مرات تكرار رقم نسخة النموذج. في هذا البروتوكول، تم استخدام الكتابة شبه الآلية، أو qKAT، لنسخ جينات KIR من نوع الرقم. وكان عدد النسخ الأكثر شيوعا لـ KIR2DL4 نسختين في حين أن عدد النسخ الأكثر تكرارا لـ KIR3DS1 كان صفرا.
أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم للغاية التأكد من أن الحمض النووي يتم قياسه بدقة ، لإجراء جميع الخطوات على الجليد ، والتأكد من أن الكواشف مغطاة من الضوء. ومن المهم أيضاً إجراء فحوصات دقيقة على البيانات الخام الخاصة بالعينات التي لا تتوافق مع قواعد LD المعروفة لجينات KIR. بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ أساليب أخرى مثل التسلسل من أجل الإجابة على أسئلة إضافية، على سبيل المثال، وجود جينات الاندماج، أو تحديد الأليلات الجديدة.
بعد تطورها، مهدت هذه الطريقة الطريق للباحثين في مجال علم الوراثة المناعية لاستكشاف دور كير في بيولوجيا الخلايا NK، ومقاومة المرض، والتكاثر البشري.
